核酸应用使用修改的 Beer-Lambert 等式(如右图所示)计算样品浓度,其中消光系数和光程相结合,被称为“系数”。 |
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使用 Beer-Lambert 等式中的术语,系数 (f) 被定义为: 系数 (f) = 1/(e * b) 其中: e = 波长相关的摩尔消光系数,单位为 ng-cm/µL 作为结果,分析物浓度 (c) 计算为: c = A * [1/(e * b)] 或者 c = A * f 其中: c = 分析物浓度,以 ng/µL 为单位 A= 吸光度,以吸光度单位表示 (A) f = 系数,以 ng-cm/µL 为单位(见下文) |
对于 dsDNA、ssDNA 和 RNA 应用,公认的核酸系数联合 Beer 定律用于计算样品浓度。 对于用户自定义系数应用,将会使用用户指定的系数。 |
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• dsDNA (系数 = 50 ng-cm/µL) • ssDNA (系数 = 33 ng-cm/µL) • RNA (系数 = 40 ng-cm/µL) • 用户自定义系数(用户输入的介于 15 ng-cm/µL 和 150 ng-cm/µL 之间的系数) |
计算的核酸浓度基于 260 nm 处的吸光度、使用的系数和样品光程。 也会应用单点基线矫正(或分析矫正)。 报告的浓度以质量为单位。 互联网上提供了计算器,用于根据样品序列,将浓度单位从质量转换为摩尔。 260 nm、280 nm 和有时候 230 nm 处的吸光度值,用于计算所检测核酸样品的纯度比。 纯度比对样品中存在的污染物敏感,如通常在样品纯化过程中使用的残余溶剂和试剂。
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检测值 注:对于微体积吸光度检测和使用非标准(10 mm 以外)
• 核酸吸光度值使用标准化光谱图在 260 nm 处检测。 如果未选择基线矫正,这是报告的 A260 值。 • 如果选择了基线矫正,矫正波长的吸光度值将减去 260nm 处吸光度。 将报告 260 nm 处已矫正吸光度并可用于计算核酸浓度。 • 230 nm 和 280 nm 处标准化和基线已矫正(如选择)吸光度值用于计算 A260/A230 和 A260/A280 比率。 |
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• 对于微体积检测,软件将根据分析波长处的样品吸光度,选择最佳光程(介于 1.0 mm 和 0.03 mm 之间)。 • 对于比色皿检测,使用切换至比色皿模式后选择 • 显示的光谱和吸光度值归一化为 10 mm 光程当量。
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• 核酸浓度。 以选中的单位(即 ng/µL、µg/uL 或 µg/mL)报告。 使用矫正的核酸吸光度值,基于修改的 Beer 定律等式计算。
• A260/A280 纯度比。 260 nm 处矫正吸光度与 280 nm 处矫正吸光度的比率。 ~1.8 的 A260/A280 纯度比通常可接受为“纯”DNA(RNA 为 ~2.0)。 酸性溶液的报告值可能少 0.2-0.3;而碱性溶液则相反。
• A260/A230 纯度比。 260 nm 处矫正吸光度与 230 nm 处矫正吸光度的比率。 处于 1.8 和 2.2 之间的 A260/A230 纯度比通常被接受为“纯”DNA 和 RNA。 注:虽然纯度比是样品质量的重要指标,但质量的最好指标是目标下游应用的功能(例如,实时 PCR)。 • 污染物 - 如果 Acclaro 软件识别出污染物,则将在此列中显示该污染物。 • 系数。 结合 Beer 定律计算样品浓度。 |
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• 污染物。 如果 Acclaro 软件识别出污染物,则将在此列中显示该污染物。 • 已矫正。 显示使用 Acclaro 软件(如可用)测定的矫正后分析物浓度。 • 试剂盒名称。 提供用于确定 qPCR 配方计算的 qPCR 试剂盒的名称(如果在设置期间选择 qPCR 试剂盒)。 • 样品稀释比例。 如果建议在 qPCR 前进行样品稀释,显示所检测样品体积对比稀释液最终体积的结果。 • 需要稀释:稀释液体积 (µL)。 如果建议在 qPCR 前稀释样品,则显示添加至稀释试管原始核酸样品的体积。 • 需要稀释:稀释液体积 (µL)。 如果建议在 qPCR 前稀释样品,则显示添加至稀释试管稀释液的体积。 • 试剂盒反应:核酸体积 (µL)。 如果需要稀释字段未建议进行稀释,则表明将添加至 qPCR 反应试管的原始核酸样品体积。 如果需要稀释字段建议进行稀释,则表明将添加至 qPCR 反应试管中的核酸稀释液体积。 |
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• 搅拌器。 若某型号的比色皿未使用搅拌器功能,则将显示“Off(关闭)”。 当使用搅拌器功能时,会显示搅拌速度。 |