蛋白质 A280 Pro 应用使用 Beer-Lambert 等式关联吸光度和浓度。 用 Beer 定律求解浓度得出右侧等式。
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c = A / (e * b) 其中: A = 紫外吸光度,以吸光度单位表示 (AU) e = 波长相关的摩尔吸光系数(或消光系数),单位为 l/mol-cm (升/摩尔 - 厘米) c = 分析物浓度,单位为摩尔/升或摩尔单位 (M) 注:将检测的样品溶液吸光度值,除以其摩尔消光系数,
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肽或蛋白质的消光系数与其色氨酸 (W)、酪氨酸(Y)和半胱氨酸(C)的氨基酸组成相关。 提示:各蛋白质的消光系数具有波长特异性,并会受到缓冲类型、离子强度和 pH 值的影响。 |
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蛋白质的消光系数 在 280 nm 处,消光系数是 280 nm 处三个氨基酸组分的摩尔消光系数近似加权总和,如下述等式所述: e = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125) 其中:e = 摩尔消光系数 |
此应用提供六个选项(如右侧所示),可选择每个检测样品的适当消光系数,联合 Beer 定律用于计算样品浓度。 如果样品的消光系数未知,可选择 e + MW(摩尔)或 e1%(质量)选项并输入数值。 否则,计算消光系数或选择最匹配样品溶液的选项。 提示:理想情况下,消光系数应该凭经验通过使用相同缓冲液的已知浓度研究蛋白质溶液来确定。
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• 1 Abs = 1 mg/mL,样品类型和/或消光系数未知 • BSA(牛血清蛋白,6.7 L/gm-cm) • IgG(任何哺乳动物抗体,13.7 L/gm-cm) • 溶菌酶(蛋白溶菌酶,26.4 L/gm-cm) • 其他蛋白质 (e + MW),用户指定摩尔消光系数 • 其他蛋白质 (e1%),用户指定质量消光系数 注:详细信息请参阅样品类型。 |
大多数来源报告的蛋白质消光系数在或接近 280 nm 处检测磷酸盐或其他生理缓冲液。 这些值为蛋白质浓度常规评估提供了足够的精度。 |
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发布的蛋白质消光系数可能报告为: • 波长相关的摩尔吸光(或消光)系数 (e),单位为 M-1cm-1 • 百分比溶液消光系数 (e1%),单位为 (g/100mL)-1cm-1 • 0.1% (即,1 mg/mL) 溶液的蛋白质吸光度值 提示:仔细评估已发布的值,确保使用正确的检测单位。 |
右侧等式显示摩尔消光系数 (emolar) 和百分比消光系数 (e1%) 之间的关系。 |
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emolar 和 e1% 之间的换算 (emolar) * 10 = (e1%) * (MWprotein) 示例:若要确定一种蛋白质的百分比溶液消光系数 (e1%)(其中蛋白质的摩尔消光系数为 43,824 M-1cm-1,分子量 (MW) 为 66,400 道尔顿 (Da)),则重新安排并求解上述等式,具体如下: e1% = (emolar * 10) / (MWprotein)) e1% = (43,824 * 10) / 66,400 Da) e1% = 6.6 g/100 mL |
若要确定单位为 mg/mL 的样品浓度 (c),使用右边的等式和转换系数 10。 提示:NanoDrop Ultra 软件包括在报告蛋白质浓度的换算系数。 |
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在 g/100 mL 和 mg/mL 之间进行换算 Cprotein in mg/mL = (A / e1%) * 10 示例:如果某蛋白质样品在 280 nm 处检测的吸光度为 5.8 A(相对于参考品),则蛋白质浓度可计算为: Cprotein = (A / e1%) * 10 Cprotein = (5.8/6.6 g/100 mL) * 10 Cprotein = 8.79 mg/mL |
计算的蛋白质浓度基于 280 nm 处的吸 报告的浓度以质量为单位。 互联网上提供了计算器,用于根据样品序列,将浓度单位从质量转换为摩尔。
260 nm 和 280 nm 处的吸光度值,用于计算所检测蛋白质样品的纯度比。 纯度比对样品中存在的污染物敏感,如通常在样品纯化过程中使用的残余溶剂和试剂。 |
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A280 吸光度 注:对于微体积吸光度检测和使用非标准(10 mm 以外)
• 使用标准化光谱图在 280 nm 处检测蛋白质吸光度值。 如果没有选择基线矫正,这是报告的 A280 值和用于计算蛋白质浓度值。 • 如果选择基线矫正,则将报告 280 nm 处的标准化和基线矫正吸光度值,并用于计算蛋白质浓度。 A260 吸光度
• 使用 260 nm 处的归一化和基线矫正(如果选择)吸光度值计算 A260/A280 比率。
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样品光程 • 对于微体积检测,软件将根据分析波长处的样品吸光度,选择最佳光程(介于 1.0 mm 和 0.03 mm 之间)。 • 对于比色皿检测,使用切换至比色皿模式后选择 • 显示的光谱和吸光度值归一化为 10 mm 光程当量。 |
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• 蛋白质浓度。 以选中的单位(mg/mL 或 µg/mL)报告。 使用蛋白吸光度值基于 Beer-Lambert 等式计算。 • A260/A280 纯度比。 260 nm 处已矫正吸光度与 280 nm 处已矫正吸光度的比率。 ~0.57 的 A260/A280 纯度比通常可接受为“纯”蛋白质。 注:虽然纯度比是样品质量的重要指标,但是,蛋白质质量的最好指标是目标下游应用的功能(例如,实时 PCR)。 • 基线矫正。 选择用于基线矫正的波长,并检测该波长下的吸光度。 • 监测波长。 输入一个您期望在报告中纳入其吸光度值的额外波长。 • 质量消光系数(1% 溶液)。 • 摩尔消光系数。 • 分子量。 • 污染物。 如果Acclaro 软件中,污染物将显示在此列中。 • 已矫正。 显示使用 Acclaro 软件(如可用)测定的矫正后分析物浓度。 • 搅拌器。 若某型号的比色皿未使用搅拌器功能,则将显示“Off(关闭)”。 当使用搅拌器功能时,会显示搅拌速度。
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