对于 dsDNA、RNA 和蛋白质 A280 应用,NanoDrop Ultra 软件将会在检测过程中,
自动启动用于数种已知污染物的光谱分析。 已知污染物的示例包括:
• 对于 dsDNA 和 RNA 检测:
–在分析区域中:蛋白质和苯酚
–检测是否存在盐酸胍和异硫氰酸胍
–在 RNA 应用中检测种属特异性 dsDNA 污染,并在 dsDNA 应用中检测种属特异性 RNA 污染
• 对于蛋白质检测:
–在分析区域中:核酸和苯酚
如果鉴定了样品中的污染物,“污染物分析”图标将显示在检测结果的左边。
点击该图标可查看污染物分析和相关信息。
以下是来自核酸污染物分析的结果示例,该分析包含足以影响检测结果的蛋白质污染物。
1基于样品总吸光度(样品加上污染物)
2基于矫正的样品总吸光度(样品减去污染物)
由于蛋白质在核酸的分析波长(230 nm、260 nm 和 280 nm)附近吸收光,上图所示核酸样品中存在的蛋白质使 A260/A280 和 A260/A230 比率超出范围,并导致报告核酸污染物高于实际值。 软件将鉴定杂质(蛋白质)并报告下列各项:
• 分析波长 (260 nm) 处由于蛋白质 (0.18) 造成的基线矫正吸光度
• 检测结果变异系数 %(不确定性 x 100/检测结果 = 14.03%;高 %CV 表示检测结果接近仪器检测限制,或者有干扰元素)
• 基于分析波长处总基线矫正吸光度(样品加上污染物)的原始核酸浓度 (59.5 ng/µL)
• 基于分析波长处矫正吸光度(样品减去污染物)的矫正核酸浓度 (49.5 ng/µL)
污染物分析原理
紫外和紫外-可见光吸光度检测,用于分别定量分析在 260 nm 及 280 nm 处的核酸和蛋白质样品。 该分析基于混合物溶液在给定波长处的总吸光度是混合物中每个成分的吸光度值之和。
这种方法目前面临的挑战是,提取过程中使用的一些材料可以在整个光谱中的不同区域吸光。 当样品存在这些污染物时,它们会假增加目标波长处的吸光度,导致分析物浓度被高估,从而干扰了分析。
在通常情况下,纯度比用于检测是否存在会影响下游应用的污染物。 然而,纯度比不会始终提供可能污染物的完整状况。 当纯度比超出预期的范围时,光谱剖面曲线经常会进行定性检查。
我们的 Acclaro 技术对污染物分析采用定量方法。 Acclaro 通过复杂的数学算
法分析光谱数据以鉴定样品中可能的污染物,并去除样品中污染物对结果造成的任何影响。 这将可产生更精确的目标分析物浓度值,以及更为定性地分析污染程度。
由于纯化合物的光谱是该化合物独有的,因此,大多数具有一些相互作用的已知材料,可通过数学方式分解成其成分光谱和鉴定的成分。 污染物分析算法使用分析波长(核酸为 260 nm,蛋白质为 280 nm)周围的窄光谱区域 (220-285 nm),确定
是否有在该区域吸光的潜在已知污染物(蛋白质或核酸,和苯酚)增加的任何吸光度。 整个光谱将进行分析,确定是否存在其他可能的污染物,如盐酸胍和/或异硫氰酸胍,它们是用于核酸纯化的常用试剂。
注 实现一致、高质量的污染物分析结果,依赖于检测的样品光谱质量,而这取决于仪器的维护状态。 有关详细信息,请参阅“维护时间表”。 |