使用二辛可宁酸比色法检测试剂来检测未纯化蛋白质样品的总蛋白浓度。 |
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蛋白质 BCA 法分析理论
蛋白质BCA 法分析采用二辛可宁酸 (BCA) 作为用于 Cu+1 的检测试剂,它在 Cu+2 于碱性环境中减少某些蛋白质时形成。 紫色反应产物是由两个 BCA 分子与一个亚铜离子 (Cu+1) 螯合作用形成。 蛋白质中产生的 Cu-BCA 螯合作用在 562nm 处检测,并在 750nm 处使用吸光度值进行基线矫正。 我们或本地经销商均有提供预先配制的 BCA 试剂和 CuSO4 试剂盒。
有关 NanoDrop Ultra 仪器的最新试剂盒和实验方案,请访问 NanoDrop 网站。 遵循测定试剂盒制造商对所有标准品和样品(未知)提供的建议。 确保每份样品在整个检测过程中的时间设置和温度均相同。
试剂盒制造商也提供了用于产生标准曲线的蛋白标准品。 由于 NanoDrop Ultra 基座可以比基于比色皿的传统分光光度计检测更高的蛋白浓度,因此,您可能需要自备浓度高于制造商所提供浓度的蛋白标准品。 例如,可能需要额外的标准品来确保标准曲线覆盖未知样品的测定范围和预期范围。
比色法蛋白质分析需要使用标准曲线。
• 每项实验均需使用标准曲线。 您可以运行新的标准曲线或从之前运行的实验中导入标准品。
• 若要导入之前运行的标准曲线,在应用设置屏幕上,选择 Load Standards
(加载标准品)选项,选择一个之前运行的可用标准曲线,并选择
Save(保存)。
• 用相同的方法制备标准品和未知样品。 请参阅试剂盒制造商的指导原则和
建议。
–全部参考品和标准品溶液应该是位于再悬浮样品以及在样品中加入相同体积试剂的相同缓冲液。
–首份标准品是参考品检测。 参考品溶液不应含有目标分析物。 (参考品检测与空白检测不同。 此应用需要两者。)
–标准品的浓度范围必须覆盖分析方法的动态范围和未知样品的预期范围。 样品分析物浓度不能超过最高标准的浓度的推算。
• 使用应用设置屏幕的 Setup Standards(设置标准品)选项输入标准品的浓度值,以及指定标准品和样品该如何检测(例如重复次数和曲线类型等)。
–根据曲线类型设置,可使用两份或更多标准品生成标准曲线。
–该软件需要一份参考品检测,且允许至多 7 份标准品检测。
–标准品的浓度值可以以任何顺序输入,但标准品必须以其输入的顺序检测,然而,最佳实践决定标准品的检测从蛋白标准品制备的最低浓度到最高。
• 对于所有比色法分析,除了蛋白质 Pierce 660 法之外,使用 DI H2O(去离子水)对仪器进行空白检测。 对于蛋白质 Pierce 660 法,使用参考品溶液进行空白检测(如下所示)。
• 在开始分析样品之前,检测参考品和全部的标准品。 在检测第一份样品后,不允许对标准曲线作出任何更改。
当您检测标准品时,将会显示检测屏幕,类似于样品的检测屏幕。
使用 PC 控制软件时,选择 Curve(曲线)选项卡可查看构建的标准曲线。
R2值表示标准曲线拟合标准品数据点的程度(1.0 表示完美拟合;所有的点恰好落到曲线上)。
在针对选定曲线类型检测最低数量标准品后,将会显示类似于以下的消息:
重新检测标准品: 返回至标准检测屏幕,可以在其中选择先前运行的标准品检测并重新运行。
–从标准品检测屏幕、标准曲线屏幕或标准品数据表,按住一个行可显示Sample Details(样品详细信息)框。
–选择 Remeasure(重新检测),然后选择 Yes(是)以确认。
加载更多标准品: 返回至设置屏幕,您可以在其中添加或编辑任何标准品的
浓度值,然后选择 Save(保存)进行检测。 如果您已检测最大允许数量的标准品,则此选项将不可用。
检测样品:继续到样品检测屏幕后,即不能再对标准品进行编辑。
注 您可以在选择 Measure Samples(检测样品)之前随时添加、 |
添加标准品:
–在标准品检测屏幕中,选择 。
–选择下一个空的浓度字段,并输入新标准品的浓度值。
–选择 Save(保存)。
编辑标准品:
–在标准品检测屏幕中,选择 。
–点击浓度字段,然后编辑浓度值。
–选择 Save(保存)。
–从标准品检测屏幕、标准曲线屏幕或标准品数据表,按住该行可显示样品详细信息框。
–选择 。
–选择 Yes(是)可确认。
检测屏幕上的表中不再显示标准品,且在设置屏幕上不再显示其浓度值。
注 您可以使用此方法删除参考品检测;但是,之后必须立即检测新的参 |
• 在针对选中曲线类型检测所有标准品后,将显示“Standards Completed
(标准品检测已完成)”消息。 如果在检测所有输入的标准品后出现消息“Invalid Standards(无效标准品)”,请尝试:
–选择一个不同的曲线类型
–使用正确的标准材料重新检测标准品
注 该信息仅提示已确定选定曲线类型所需的最小点数。 它没有验证曲线的完整性。 例如,可能需要额外的标准品来覆盖预期的检测浓度范围。 |