OD600 应用的理论
OD600 应用检测光透射率,并利用该值计算吸光度。 在光谱中,投射光被定义为不被样品吸收、反射和散射的任何光。
在活细胞的情况下,大部分的入射光会通过样品透射,而不是散射、反射或吸收。 散射光的量很低,根据不同仪器而有所不同。 作为结果,计算出的吸光度读数通常很低。
所计算的吸光度值用于确定溶液中的细胞的密度,单位为细胞数/mL。 与活细胞光学性质至浓度相关的物理概念和公式包括:
• 细胞,它具有来自周围介质的不同折射率,随机反射和散射入射光路径的光。 散射量与样品中细胞密度成正比。
• Beer 定律等式用于关联吸光度与浓度。 有关详细信息,请参阅
“OD600 检测计算”。
• 对于使用 NanoDrop Ultrac 和 NanoDrop Ultrac FL 仪器读取的比色皿,准确的吸光度读数范围通常在 0.04 A 和 1.5 A 之间。 样品的连续稀释通常需要处于这个范围内的吸光度读数。
• 所有检测应使用相同的分光光度计类型和检测方法(即,基座与比色皿的比较),因为基于光学结构,所捕捉到的散射光量会有所不同。 当使用不同的分光光度计或检测方法时,计算并应用转换系数至报告的结果。 例如,使用基座与比色皿比较内径读数,转换系数可以计算如下:
换算系数 = 比色皿内径/基座内径
• 确保样品处于仪器的吸光度检测范围内。
• 细胞悬浮生长或培养基空白检测。
• 运行空白检测周期评估培养基溶液增加的吸光度。 如果培养基在分析波长(600 nm)处或附近表现出强吸光度,您可能需要选择不同的培养基溶液或应用。 有关更多信息,请参阅“选择和进行空白检测”。
• 在培养基达到稳定期前,如有必要可进行稀释,确保样品培养不超过分析的线性动态范围。 线性范围在很大程度上取决于光学结构,因此,基座和比色皿检测的结果会有所不同。 若要确定线性范围:
–使用微生物菌种的年轻过夜培养(~16 小时)检测一系列的稀释样品
–OD600 检测图形与稀释系数
检测上限是检测的 OD600 值,其中稀释系数和 OD600 读数之间不再是线
性关系。
• 在轻轻且彻底混合样品后,立即进行等分检测。
• 用于微体积检测:
–混合和转移样品时,避免引入气泡。
–立即开始检测以避免沉淀或蒸发。
–遵循微体积检测的最佳实践。
–使用 2 µL 样品体积。 有关详细信息,请参阅“推荐的样品体积”。
–对于在 600nm 处展现低吸光度的稀释样品,使用另一种波长,如 400nm 来检测吸光度,或使用比色皿而不是微体积检测。
• 对于比色皿检测(仅限 NanoDrop UltraC 和 NanoDrop UltraC FL 仪器):
–使用干净的塑料、玻璃或石英比色皿。
–遵循比色皿检测的最佳实践。
–切勿使用该分析的自动搅拌功能。