计算

核酸应用使用修改的 Beer-Lambert 等式(如右图所示)计算样品浓度,其中消光系数和光程相结合,被称为“系数”。

 

消光系数与系数

使用 Beer-Lambert 等式中的术语,系数 (f) 被定义为:

系数 (f) = 1/(e * b)

其中:

e = 波长相关的摩尔消光系数,单位为 ng-cm/µL
b =
样品光程,单位为 cm

作为结果,分析物浓度 (c) 计算为:

c = A * [1/(e * b)]

或者

c = A * f

其中:

c = 分析物浓度,以 ng/µL 为单位

A= 吸光度,以吸光度单位表示 (A)

f = 系数,以 ng-cm/µL 为单位(见下文)

对于 dsDNA、ssDNA 和 RNA 应用,公认的核酸系数联合 Beer 定律用于计算样品浓度。 对于用户自定义系数应用,将会使用用户指定的系数。

 

使用的系数

dsDNA (系数 = 50 ng-cm/µL)

ssDNA (系数 = 33 ng-cm/µL)

RNA (系数 = 40 ng-cm/µL)

用户自定义系数(用户输入的介于 15 ng-cm/µL 和 150 ng-cm/µL 之间的系数)

计算的核酸浓度基于 260 nm 处的吸光度、使用的系数和样品光程。 也会应用单点基线矫正(或分析矫正)。

报告的浓度以质量为单位。 互联网上提供了计算器,用于根据样品序列,将浓度单位从质量转换为摩尔。

260 nm、280 nm 和有时候 230 nm 处的吸光度值,用于计算所检测核酸样品的纯度比。 纯度比对样品中存在的污染物敏感,如通常在样品纯化过程中使用的残余溶剂和试剂。

 

 

检测值

注:对于微体积吸光度检测和使用非标准(10 mm 以外)
比色皿进行的检测,光谱将归一化为 10 mm 光程当量。

 

A260 吸光度

核酸吸光度值使用标准化光谱图在 260 nm 处检测。 如果未选择基线矫正,这是报告的 A260 值。

如果选择了基线矫正,矫正波长的吸光度值将减去 260nm 处吸光度。 将报告 260 nm 处已矫正吸光度并可用于计算核酸浓度。

A230 和 A280 吸光度

230 nm 和 280 nm 处标准化和基线已矫正(如选择)吸光度值用于计算 A260/A230 和 A260/A280 比率。

 

 

样品光程

对于微体积检测,软件将根据分析波长处的样品吸光度,选择最佳光程(介于 1.0 mm 和 0.03 mm 之间)。

对于比色皿检测,使用切换至比色皿模式后选择
的光程。 (请参阅“比色皿设置”

显示的光谱和吸光度值归一化为 10 mm 光程当量。

 

 

 

报告

核酸浓度。 以选中的单位(即 ng/µL、µg/uL 或 µg/mL)报告。 使用矫正的核酸吸光度值,基于修改的 Beer 定律等式计算。

 

A260/A280 纯度比。 260 nm 处矫正吸光度与 280 nm 处矫正吸光度的比率。 ~1.8 的 A260/A280 纯度比通常可接受为“纯”DNA(RNA 为 ~2.0)。 酸性溶液的报告值可能少 0.2-0.3;而碱性溶液则相反。

 

A260/A230 纯度比。 260 nm 处矫正吸光度与 230 nm 处矫正吸光度的比率。 处于 1.8 和 2.2 之间的 A260/A230 纯度比通常被接受为“纯”DNA 和 RNA。

:虽然纯度比是样品质量的重要指标,但质量的最好指标是目标下游应用的功能(例如,实时 PCR)。

系数。 结合 Beer 定律计算样品浓度。

污染物 - 如果 Acclaro 软件识别出污染物,则将在此列中显示该污染物。

系数。 结合 Beer 定律计算样品浓度。

基线矫正。 选择用于基线矫正的波长,以及在该波长下检测到的吸光度。

位置。 显示检测结果是否取自基座或比色皿模式。

监测波长。 输入一个您期望在报告中纳入其吸光度值的额外波长。

 

 

污染物。 如果 Acclaro 软件识别出污染物,则将在此列中显示该污染物。

已矫正。 显示使用 Acclaro 软件(如可用)测定的矫正后分析物浓度。

种类。 Acclaro 软件检出的核酸污染物种类

试剂盒名称。 提供用于确定 qPCR 配方计算的 qPCR 试剂盒的名称(如果在设置期间选择 qPCR 试剂盒)。

样品稀释比例。 如果建议在 qPCR 前进行样品稀释,显示所检测样品体积对比稀释液最终体积的结果。

需要稀释:稀释液体积 (µL)。 如果建议在 qPCR 前稀释样品,则显示添加至稀释试管原始核酸样品的体积。

需要稀释:稀释液体积 (µL)。 如果建议在 qPCR 前稀释样品,则显示添加至稀释试管稀释液的体积。

试剂盒反应:核酸体积 (µL)。 如果需要稀释字段未建议进行稀释,则表明将添加至 qPCR 反应试管的原始核酸样品体积。 如果需要稀释字段建议进行稀释,则表明将添加至 qPCR 反应试管中的核酸稀释液体积。

试剂盒反应:水体积 (µL)。 显示将添加至 qPCR 反应试管的水的体积。

试剂盒反应:最终模板浓度。显示添加至 qPCR 反应试管后核酸样品的浓度。

 

 

搅拌器。 若某型号的比色皿未使用搅拌器功能,则将显示“Off(关闭)”。 当使用搅拌器功能时,会显示搅拌速度。

加热器。 将显示“Off(关闭)”或“On(开启)”,以表明比色皿端口在检测期间被加热。

实测温度。 将显示检测期间的比色皿端口温度。

目标温度。 将显示比色皿端口期望温度。