计算

Acclaro Pro 核酸应用使用修改的 Beer-Lambert 等式(如右图所示)计算样品浓度,其中消光系数和光程相结合,
被称为“系数”。

 

消光系数与系数

使用 Beer-Lambert 等式中的术语, 系数 (f) 被定义为:

系数 (f) = 1/(e * b)

其中:
e = 波长相关的摩尔消光系数,单位为 ng-cm/μL
b = 样品光 程, 单位为 cm

作为结果,分析物浓度 (c) 计算为:

c = A * [1/(e * b)]

或者

c = A * f

其中:
c = 分析物浓度,以 ng/μL 为单位
A = 吸光度,以吸光度单位表示 (A)
f = 系数,以 ng-cm/μL 为单位(见下文)

对于dsDNA Pro、ssDNA Pro和 RNA Pro
应用,公认的核酸系数联合 Beer 定律用于计算样品浓度。对于用户自定义系数 Pro 应用,将会使用用户指定的系数。

 

使用的系数

dsDNA (系数 = 50 ng-cm/μL)

ssDNA (系数 = 33 ng-cm/μL)

RNA (系数 = 40 ng-cm/μL)

用户自定义系数 (用户输入的介于 15 ng-cm/μL
和 150 ng-cm/μL 之间的系数)

计算的核酸浓度基于 260 nm处的吸
光度、 使用的系数和样品光程。也会应用单点基 线矫正(或分析矫正)。

报告的浓度以质量为单位。互联网上提供 了计算器,用于根据样品序列,将浓度单 位从质量转换为摩尔。

260nm 、280nm 和有时候230nm处的吸光 度值,用于计算所检测核酸样品的纯度比。 纯度比对样品中存在的污染物敏感,如通常在样品纯化过程中使用的残余溶剂和试剂。

 

 

检测值

注: 对于微体积吸光度检测和使用非标准(10 mm 以外)
比色皿进行的检测,光谱将归一化为 10 mm 光程当量。

 

A260 吸光度

核酸吸光度值使用标准化光谱图在260 nm处检测。如果 未选择基线矫正,这是报告的 A260 值。

如果选择了 基线矫正 ,矫正波长的吸光度值将减去260nm 处吸光度。 将报告260 nm处已矫正吸光度并可 用于计算核酸浓度。

A230 和 A280 吸光度

230nm 和280nm处标准化和基线已矫正(如选择)吸光 度值用于计算 A260/A230 和 A260/A280 比率。

 

 

报告值

核酸浓度。 以选中的单位(即 ng/μL、μg/uL 或 μg/mL) 报告。使用矫正的核酸吸光度值,基于修改的 Beer 定律 等式计算。

 

A260/A280纯度比。 260nm处矫正吸光度与280nm处矫 正吸光度的比率。 ~1.8 的A260/A280 纯度比通常可接受 为“纯”DNA(RNA 为 ~2.0)。酸性溶液的报告值可能少 0.2-0.3;而碱性溶液则相反。

 

A260/A230纯度比 260nm处矫正吸光度与230nm处矫 正吸光度的比率。处于 1.8 和 2.2 之间的 A260/A230 纯 度比通常被接受为“纯”DNA 和 RNA。

注: 虽然纯度比是样品质量的重要指标,但质量的最好指标 是目标下游应用的功能(例如,实时 PCR)。

A260 吸光度。 

A280 吸光度。

R2 (260nm)。 260 nm 测量的最佳拟合线确定系数。

系数。 结合 Beer 定律计算样品浓度。

基线矫正。选择用于基线矫正的波长,以及在该波长下 检测到的吸光度。

位置。显示检测结果是否取自基座或比色皿模式。

监测波长。 输入一个您期望在报告中纳入其吸光度值的 额外波长。