与其他核酸应用一样,基因芯片应用使用修改的 Beer-Lambert 等式 计算样品浓度,其中消光系数和光程统称为“系数”。 基因芯片应用提供六个选项(如右图 如果该系数已知,请选择“用户自定义系数”选项然后输入系数,单位为 ng-cm/µL。 否则,选择与样品溶液最佳匹配的选项。 提示:理想情况下,应通过使用相同缓冲液的已知浓度研究核酸溶液凭经验确定系数或消光系数。 |
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• dsDNA (系数 = 50 ng-cm/µL) • ssDNA (系数 = 33 ng-cm/µL) • RNA (系数 = 40 ng-cm/µL) • 寡核苷酸 DNA(根据用户输入的 DNA 核苷酸序列 • 寡核苷酸 RNA(根据用户输入的 RNA 核苷酸序列 • 用户自定义系数(用户输入的介于 15 ng-cm/µL 和 150 ng-cm/µL 之间的系数) 注:有关详细信息,请参阅 样品类型。 |
计算的核酸浓度基于 260 nm 处的吸光度、使用的系数和样品光程。 也会应用单点基线矫正(或分析矫正)。 报告的浓度以质量为单位。 互联网上提供了计算器,用于根据样品序列,将浓度单位从质量转换为摩尔。 260 nm、280 nm 和有时候 230 nm 处的
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检测值 注:850 nm 处的吸光度值从光谱中所有波长处的吸光度值减去。 因此,所显示光谱中 850 nm 处的吸光度值为零。 对于微体积吸光度检测和使用非标准(10 mm 以外)比色皿进行的检测,光谱将归一化为 10 mm 光程当量。
• 对于全部基因芯片样品类型的核酸吸光度值,使用 • 如果选择了分析矫正,则将矫正波长处的吸光度值从 260 nm 处的吸光度值减去。 • 如果选择了一种或多种染料,260 nm 处的染料矫正值也将从 260 nm 处的吸光度值减去。 • 报告了 260 nm 处的最终已矫正吸光度,并用于计算样品浓度。 • 280 nm 处的 850-已矫正和标准化吸光度值(减去 A280 染料矫正吸光度值)用于计算 A260/A280 比率。 |
染料浓度从染料分析波长处的吸光值、染料的消光系数和样品光程计算。
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• 染料吸光度在特定波长处检测。 有关使用的分析波长信息,请参阅“染料/色谱图编辑器”。 • 将显示基线矫正染料吸光值并用于计算染料浓度。 染料矫正 • 预定义染料具有 A260 和 A280 的已知矫正值。 有关所使用矫正值的信息,请参阅“染料/色谱图编辑器”。
• A260 染料矫正值将从用于计算核酸浓度的 A260 吸光度值减去,也将从用于计算 A260/A280 纯度比的 A260 吸光度值减去。 |
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样品光程 • 对于微体积检测,软件将根据分析波长处的样品吸 • 对于比色皿检测,使用切换至比色皿模式后选择的 • 显示的光谱和吸光度值归一化为 10 mm 光程当量。 |
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• 核酸浓度。 以选中的单位(即 ng/µL、µg/uL 或 µg/mL)报告。 使用矫正的核酸吸光度值,基于修改的 Beer 定律等式计算。
• A260/A280 纯度比。 260 nm 处已矫正吸光度与 280 nm 处已矫正吸光度的比率。 ~1.8 的 A260/A280 纯度比通常可接受为“纯”DNA(RNA 为 ~2.0)。 酸性溶液的报告值可能少 0.2-0.3;而碱性溶液则相反。 • 染料 1/染料 2 浓度。 以 pmol/µL 为单位报告。 使用基线矫正染料吸光值基于 Beer 定律等式进行计算。
注:虽然纯度比是样品质量的重要指标,但 DNA 或 RNA 质量的最佳指标是目标下游应用(例如基因芯片)的功能。
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• 核酸检测计算