计算

与其他核酸应用一样,寡核苷酸应用使用Beer-Lambert 等式关联基于样品消光系数和光程的吸光度和浓度。 由于寡核苷酸是短的单链分子(或重复序列的较长分子),其光谱和消光系数 (e) 与碱基组成和序列密切相关。

(用于单链 DNA 和 RNA 的公认消光系数和系数提供自然合理的估计,基本上是随机序列,但并不适合短的合成寡核苷酸序列。) 为了确保最准确的结果,我们使用 e260 的精确值计算寡核苷酸浓度。

NanoDrop 软件允许您在检测之前指定寡核苷酸的碱基序列。 对于任何输入的碱基序列,该软件在右侧使用等式计算消光系数。

 

用于寡核苷酸的消光系数

该软件采用最近邻检测方法和以下公式计算特定寡核苷酸碱基序列的摩尔消光系数:

DNA_RNA00062.jpg

 

其中:

e = 摩尔消光系数(单位 L/mol-cm)

e1 = e最近邻

e2 = e单个碱基

e3 = e修饰,如荧光染料

提示:消光系数是每个寡核苷酸的特定波长,并会受到缓冲类型、离子强度和 pH 值的影响。

 

 

计算的核酸浓度基于 260 nm 处的吸光度、使用的系数和样品光程。 也会应用单点基线矫正(或分析矫正)。

报告的浓度以质量为单位。 互联网上提供了计算器,用于根据样品序列,将浓度单位从质量转换为摩尔。

260nm、280nm 和有时候 230nm 处的吸光值,用于计算所检测核酸样品的纯度比。 纯度比对样品中存在的污染物敏感,如通常在样品纯化过程中使用的残余溶剂和试剂。

 

 

检测值

A260 吸光度

注:对于微体积吸光度检测和使用非标准(10 mm 以外)比色皿进行的检测,光谱将归一化为 10 mm 光程当量。

 

核酸吸光度值使用标准化光谱图在 260 nm 处检测。 如果未选择基线矫正,这是报告的 A260 值。

如果选择了基线矫正,矫正波长的吸光度值将减去 260nm 处样品吸光度。 将报告 260nm处已矫正吸光度并可用于计算核酸浓度。

A230 和 A280 吸光度

230 nm、260 nm 和 280 nm 处标准吸光度值用于计算 A260/A230 和 A260/A280 比率。

 

 

样品光程

对于微体积检测,软件将根据分析波长处的样品吸光度,选择最佳光程(介于 1.0 mm 和 0.03 mm
之间)。

对于比色皿检测,使用切换到比色皿模式后选择的光程(请参阅“比色皿设置”)。

显示的光谱和吸光度值归一化为 10 mm 光程当量。

组成 DNA 和 RNA 的五个核苷酸展现变动很大的 A260/A280 比率。 适用于每个独立检测核苷酸的估计 A260/A280 比率如下:

鸟嘌呤:1.15
腺嘌呤:4.50
胞嘧啶:1.51
尿嘧啶:4.00
胸腺嘧啶:1.47

对于特定的核酸序列,A260/A280 比率约等于四个核苷酸的 A260/A280 比率加权平均。

注:由于与胸腺嘧啶相比,尿嘧啶具有较高比率,RNA 通常会有更高的 260/280 比率。

 

报告值

核酸浓度。 以选中的单位(即 ng/µL、µg/uL 或 µg/mL)报告。 使用矫正的核酸吸光值,基于修改的 Beer 定律等式计算。

 

A260/A280 纯度比。 260 nm 处已矫正吸光度与 280 nm 处已矫正吸光度比率。

A260/A230 纯度比。 260 nm 处已矫正吸光度与 230 nm 处已矫正吸光度的比率。

注:传统的纯度比(A260/A280 和 A260/A230),作为在核酸样品的各种污染物的指标,因为其光谱形状高度依赖于其碱基组成,所以不适用于寡核苷酸。 有关详细信息,请参阅侧边栏。

相关主题

核酸检测计算