Mesurer avec la méthode Protein Bradford
La méthode Protein Bradford repose sur l’utilisation du colorant bleu de Coomassie comme agent de détection colorimétrique pour déterminer la concentration totale en protéines dans des échantillons de protéines non purifiés. Cette application permet de mesurer les solutions de protéines diluées qui nécessitent une sensibilité de détection plus basse et les mélanges de protéines contenant des composants qui absorbent de façon significative entre 200 nm et 280 nm, rendant impossible l’analyse directe de protéines à 280 nm et à 205 nm. Cette application mesure l’absorbance à 595 nm et utilise une courbe d’étalonnage pour calculer la concentration des protéines. Consultez la rubrique Utilisation des courbes d’étalonnage pour plus d’informations. Une correction de la ligne de base à partir d’un seul point est appliquée.
Avant de commencer...
AVIS • N’utilisez pas de burette ou de flacon pulvérisateur sur ou à proximité de l’instrument car les liquides s’écouleraient dans l’instrument et pourraient causer des dommages irrémédiables. • N’utilisez pas d’acide fluorhydrique (HF) sur les socles. Les ions fluorures corroderaient irrémédiablement les câbles à fibre optique en quartz. |
Procédure
1. Sur la page d’accueil, sélectionnez l’onglet Proteins (protéines) puis appuyez sur Protein Bradford.
2. Modifiez autant d’options de configuration que souhaité et sélectionnez Save (enregistrer). (Précisez le type de courbe et le nombre de réplicats pour chaque étalon et saisissez la concentration de chaque étalon.)
Conseil : pour cette méthode, sous l’option Curve Type (type de courbe), choisissez « 2nd Order Polynomial » (polynomiale de degré 2) et sous Replicates (réplicats), indiquez « 3 ».
3. Si vous utilisez un modèle NanoDrop Ultrac ou NanoDrop Ultrac FL, sélectionnez le bon support d’analyse.
–Si vous utilisez des cuvettes, sélectionnez Cuvette dans le menu déroulant en haut de l’écran. Les paramètres relatifs aux cuvettes s’afficheront. Sélectionnez la longueur du trajet optique, la vitesse d’agitation et la température qui vous conviennent, puis fermez le menu déroulant.
–Si vous mesurez à l’aide des socles, conservez le paramètre Pedestal (socle) sélectionné en haut de l’écran.
4. Mesurer le blanc :
–Pipetez 2 µl d’H2O DI sur le socle inférieur et abaissez le bras, ou insérez une cuvette de blanc remplie d’H2O DI dans le porte-cuvette.
Conseil : si vous utilisez une cuvette, veillez à aligner son trajet optique à celui de l’instrument.
–Sélectionnez Blank (effectuer le blanc) et attendez que la mesure soit terminée.
Conseil : si le mode Auto-Measure (mesure automatique) est activé, la mesure du blanc débute automatiquement lorsque vous abaissez le bras. (Cette option n’est pas disponible pour les mesures en cuvettes.)
–Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette.
5. Mesurer l’étalon de référence :
–Pipetez 2 µl de solution de référence sur le socle, ou insérez une cuvette de référence (la solution de référence ne doit contenir aucune des protéines utilisées pour l’étalon ; consultez la rubrique Utilisation des courbes d’étalonnage pour plus de détails).
–Sélectionnez Measure (mesurer) et attendez que la mesure soit terminée.
–Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette.
–Si vous avez défini un nombre de réplicats supérieur à 1, répétez la mesure.
6. Mesurer les autres étalons :
–Pipetez 2 µl d’étalon 1 sur le socle, ou insérez une cuvette d’étalon 1.
–Sélectionnez Measure (mesurer) et attendez que la mesure soit terminée.
–Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette.
–Si vous avez défini un nombre de réplicats supérieur à 1, répétez la mesure.
–Répétez les sous-étapes ci-dessus pour chaque étalon supplémentaire (lorsque le nombre spécifié d’étalons et de réplicats a été analysé, un message s’affiche vous demandant de choisir l’une des options suivantes : mesurer à nouveau les étalons, charger d’autres étalons ou démarrer l’analyse des échantillons).
–Quand vous avez terminé de mesurer les étalons, appuyez soit sur Measure Samples(mesurer les échantillons) (balayez vers la gauche pour afficher la courbe d’étalonnage) si vous utilisez le logiciel de contrôle local soit sur l’onglet Curve (courbe) si vous utilisez le logiciel de contrôle PC.
7. Mesurer les échantillons :
–Pipetez 2 µl de l’échantillon 1 sur le socle, ou insérez la cuvette d’échantillon 1.
–Sélectionnez Measure (mesurer) et attendez que la mesure soit terminée.
–Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette.
–Si vous avez défini un nombre de réplicats supérieur à 1, répétez la mesure.
8. Lorsque vous avez terminé de mesurer les échantillons, sélectionnez End Experiment (terminer l’expérience).
9. Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette d’échantillon.
• Utiliser une courbe d’étalonnage
• Bonnes pratiques pour les mesures de protéines
• Mesurer un échantillon micro-volume
• Mesurer un échantillon à l’aide d’une cuvette
• Préparer les échantillons et les blancs
• Fonctionnement de base de l’instrument