Calculs pour les mesures d’échantillons pour biopuces

Comme pour les autres applications d’acides nucléiques, l’application Microarray (biopuce) s’appuie sur une version modifiée de l’équation de Beer-Lambert pour calculer la concentration de l’échantillon selon un « facteur » qui correspond au coefficient d’extinction et à la longueur du trajet optique combinés. L’application Microarray (biopuce) propose six options (indiquées ci-contre) pour sélectionner un facteur approprié à chaque échantillon mesuré, qui sera intégré à l’équation de la loi de Beer afin de déduire la concentration de l’échantillon respectif.

Si le facteur est connu, choisissez l’option Custom Factor (facteur personnalisé) et saisissez le facteur en ng-cm/µl. Sinon, choisissez l’option qui correspond le mieux à la solution d’échantillon.

Conseil : il est préférable que le facteur ou le coefficient d’extinction soit déterminé de manière empirique à l’aide d’une solution de l’acide nucléique à l’étude dont la concentration est connue et dilué dans le même tampon.

 

Options disponibles pour les facteurs

ADNdb (facteur = 50 ng-cm/µl)

ADNsb (facteur = 33 ng-cm/µl)

ARN (facteur = 40 ng-cm/µl)

Oligo ADN (calculé à partir de la séquence de nucléotides d’ADN saisie par l’utilisateur)

Oligo ARN (calculé à partir de la séquence de nucléotides d’ARN saisie par l’utilisateur)

Facteur personnalisé facteur compris entre 15 ng-cm/µl et 150 ng-cm/µl saisi par l’utilisateur).

Remarque : Consultez la rubrique Type d’échantillon pour plus d’informations.

Les concentrations d’acides nucléiques sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à 260 nm, du facteur utilisé et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base (ou correction d’analyse) à partir d’un seul point.

La concentration est rapportée en unités de masse. Vous trouverez sur Internet des calculateurs conçus pour convertir une concentration exprimée en masse en unités molaires en fonction de la séquence de l’échantillon.

Des valeurs d’absorbance à 260 nm, 280 nm et parfois 230 nm sont utilisées pour calculer les rapports de pureté des échantillons d’acides nucléiques mesurés. Les rapports de pureté sont sensibles à la présence de contaminants dans l’échantillon, tels que les solvants et les réactifs résiduels typiquement utilisés lors de la purification de l’échantillon.

 

 

Valeurs mesurées

Absorbance A260

Remarque : La valeur d’absorbance à 850 nm est soustraite de toutes les longueurs d’onde du spectre. Par conséquent, l’absorbance à 850 nm est nulle dans les spectres affichés. Les spectres d’absorbance des échantillons micro-volumes et des échantillons en cuvettes non standard (non de 10 mm) sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.

 

Les valeurs d’absorbance des acides nucléiques pour tous les types d’échantillons pour biopuces sont mesurées à 260 nm à l’aide d’un spectre normalisé et corrigé pour l’absorbance à 850 nm.

Si l’option Analysis Correction (correction d’analyse) est sélectionnée, la valeur d’absorbance à la longueur d’onde de correction est soustraite à celle de l’absorbance à 260 nm.

Si un ou plusieurs colorants sont sélectionnés, les valeurs de correction des colorants à 260 nm sont également soustraites de l’absorbance à 260 nm.

L’absorbance finale corrigée à 260 nm est rapportée et utilisée pour calculer la concentration de l’échantillon.

Absorbance A280

La valeur d’absorbance à 280 nm, normalisée et corrigée pour l’absorbance à 850 nm (moins la correction A280 pour le colorant) est utilisée pour déterminer un rapport A260/A280.

Les concentrations de colorant sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à la longueur d’onde d’analyse du colorant, du coefficient d’extinction du colorant et de la longueur du trajet optique de l’échantillon.

 

 

Absorbance du colorant

Les valeurs d’absorbance des colorants sont mesurées à des longueurs d’onde spécifiques. Consultez la rubrique Éditeur de colorants/chromophores pour connaître les longueurs d’onde utilisées.

Les valeurs d’absorbance du colorant corrigées pour la ligne de base sont rapportées et servent à calculer les concentrations du colorant.

Correction des colorants

Les colorants prédéfinis ont des valeurs de correction connues pour l’absorbance à 260 et 280 nm. Consultez la rubrique Éditeur de colorants/chromophores pour connaître les valeurs de correction utilisées.

 

Les corrections A260 pour les colorants sont soustraites des valeurs d’absorbance A260 utilisées pour calculer la concentration d’acides nucléiques, et des valeurs d’absorbance A260 utilisés pour calculer le rapport de pureté A260/A280.

 

 

Longueur du trajet optique de l’échantillon

Pour les mesures de micro-volumes, le logiciel sélectionne la longueur de trajet optique optimale (entre 1,0 mm et 0,03 mm) en fonction de l’absorbance de l’échantillon à la longueur d’onde d’analyse.

Les mesures en cuvettes exploitent la longueur de trajet optique sélectionnée après l’activation du mode d’analyse en cuvettes. (voir Paramètres des cuvettes).

Les spectres et les valeurs d’absorbance affichés sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.

 

 

Valeurs rapportées

Concentration d’acides nucléiques. Rapportée dans l’unité sélectionnée (c.-à-d. ng/µl, µg/ul ou µg/ml). Les calculs sont effectués en appliquant la loi de Beer modifiée et se fondent sur la valeur d’absorbance des acides nucléiques corrigée.

 

Rapport de pureté A260/A280. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 280 nm. Il est généralement accepté qu’un rapport de pureté A260/A280 d’environ 1,8 indique un échantillon d’ADN pur (~2,0 pour l’ARN). Les solutions acidiques peuvent sous-représenter la valeur rapportée par 0,2-0,3 ; l’inverse est vrai pour les solutions basiques.

Concentration du colorant 1/2. Rapportée en pmol/µl. Les calculs sont fondés sur l’équation de la loi de Beer portent sur la ou les valeurs d’absorbance du colorant corrigées pour la ligne de base.

 

Remarque : si les rapports de pureté sont des indicateurs importants de la qualité des échantillons d’ADN ou d’ARN, la meilleure façon de vérifier leur qualité est d’évaluer leurs performances dans l’application subséquente d’intérêt (p. ex., analyse sur biopuce).

 

 

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