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Tension superficielle
Les spectrophotomètres et fluoromètres NanoDrop Ultra ont recours à la tension superficielle pour maintenir un petit volume d’échantillon entre deux socles. Leur système de rétention d’échantillon breveté permet de mesurer des échantillons hautement concentrés sans qu’il soit nécessaire de les diluer.
Un câble à fibre optique intégré dans le socle supérieur relie ce dernier à une source lumineuse au xénon. Un second câble intégré dans le socle inférieur est relié à un capteur. Lorsque le bras de l’instrument est abaissé, l’échantillon forme une colonne liquide, qui sert de pont entre les deux extrémités des câbles à fibre optique.
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Spectre d’absorbance
La lumière passe à travers la colonne liquide et atteint le capteur, qui génère un spectre d’absorbance en fonction de la longueur d’onde. Le spectre montre la quantité de lumière absorbée par les molécules de l’échantillon à chaque longueur d’onde mesurée.
Remarque : pour empêcher toute évaporation, qui affecterait la précision des mesures, fermez rapidement le bras après avoir terminé de charger un échantillon ou un blanc.
L’exemple de gauche montre un spectre d’absorbance typique obtenu avec un échantillon d’acides nucléiques. Le spectre est mesuré de 190 nm à 850 nm. La plage affichée peut varier d’une application à l’autre.
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Absorbance de l’échantillon
Une fois l’instrument initialisé à blanc, un spectre de référence est obtenu avec la solution de blanc et enregistré en mémoire. Pour chaque mesure d’échantillon, les intensités de l’échantillon ainsi que celles du blanc sont prises en compte pour calculer l’absorbance totale de l’échantillon selon l’équation détaillée ci-contre.
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Équation de Beer-Lambert
où :
A = absorbance en unités d’absorbance (A)
e = absorptivité (ou coefficient d’extinction) molaire dépendant de la longueur d’onde en litres/mol-cm
b = longueur du trajet optique en cm
c = concentration de l’analyte en moles/litre ou molarité (M)
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Concentration de l’échantillon
L’équation de Beer-Lambert (loi de Beer), indiquée ci-contre, est utilisée pour corréler l’absorbance de l’échantillon avec sa concentration.
La longueur du trajet optique est la distance entre les deux socles, qui varie en temps réel lors de chaque mesure. Cette technique de longueur du trajet optique à détermination automatique donne des résultats de concentration précis sur une vaste gamme dynamique.
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Baseline correction (correction de la ligne de base)
Dans le cadre de certaines applications, l’instrument peut être configuré pour appliquer une correction de la ligne de base afin de réduire les éventuels écarts causés par les particules capables de diffuser la lumière dans les spectres de l’échantillon. La correction soustrait la valeur d’absorbance à une longueur d’onde de référence qui est proche de zéro de la valeur d’absorbance à chaque longueur d’onde sur l’ensemble du spectre, essentiellement « ancrant » le spectre à zéro unité d’absorbance à la longueur d’onde de référence.
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Fluorescence relative de l’échantillon
La LED rouge ou bleue sert de source de lumière. Cette lumière passe à travers un filtre d’excitation, la colonne liquide, puis un filtre d’émission pour atteindre le capteur qui enregistre la fluorescence relative de l’échantillon.
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Concentration de l’échantillon de fluorescence
Un algorithme d’ajustement de courbe nécessitant au moins deux étalons est utilisé pour calculer les données de concentration. Les analyses de fluorescence NanoDrop Ultra dsDNA BR, dsDNA HS et ARN HS s’appuient tous sur une courbe de Hill modifiée.
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