Mesurer avec la méthode Protein Lowry
La méthode Protein Lowry repose sur l’utilisation du composé de Folin-Ciocalteu comme réactif de détection colorimétrique pour déterminer la concentration totale en protéines d’échantillons de protéines non purifiés. Cette application peut remplacer les autres applications colorimétriques pour la mesure de solutions de protéines diluées ou de protéines en présence de composants qui absorbent de manière significative entre 200 nm et 280 nm. Cette application mesure l’absorbance à 650 nm et utilise une courbe d’étalonnage pour calculer la concentration des protéines. Consultez la rubrique Utilisation des courbes d’étalonnage pour plus d’informations. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base à partir d’un seul point.
Avant de commencer...
Avant de procéder à toute mesure sur socle, relevez le bras de l’instrument NanoDrop Ultra et nettoyez les socles supérieur et inférieur. Au minimum, essuyez les socles avec une nouvelle lingette de laboratoire. Pour plus d’informations, consultez la rubrique Nettoyer les socles.
AVIS • N’utilisez pas de burette ou de flacon pulvérisateur sur ou à proximité de l’instrument car les liquides s’écouleraient dans l’instrument et pourraient causer des dommages irrémédiables. • N’utilisez pas d’acide fluorhydrique (HF) sur les socles. Les ions fluorures corroderaient irrémédiablement les câbles à fibre optique en quartz. |
Procédure
1. Sur la page d’accueil, sélectionnez l’onglet Proteins (protéines) puis appuyez sur Protein Lowry.
2. Modifiez autant d’options de configuration que souhaité et sélectionnez Save (enregistrer).
Conseil : Pour cette méthode, sous l’option Curve Type (type de courbe), nous vous recommandons de choisir « 2nd Order Polynomial » (polynomiale de degré 2).
3. Si vous utilisez un modèle NanoDrop Ultrac ou NanoDrop Ultrac FL, sélectionnez le bon support d’analyse.
–Si vous utilisez des cuvettes, sélectionnez Cuvette dans le menu déroulant en haut de l’écran. Les paramètres relatifs aux cuvettes s’afficheront. Sélectionnez la longueur du trajet optique, la vitesse d’agitation et la température qui vous conviennent, puis fermez le menu déroulant.
–Lorsque vous utilisez les socles, conservez le paramètre Pedestal (socle) sélectionné en haut de l’écran.
4. Mesurer le blanc :
–Pipetez 2 µl d’H2O DI sur le socle inférieur et abaissez le bras, ou insérez une cuvette de blanc remplie d’H2O DI dans le porte-cuvette.
Conseil : si vous utilisez une cuvette, veillez à aligner son trajet optique à celui de l’instrument.
–Sélectionnez Blank (effectuer le blanc) et attendez que la mesure soit terminée.
Conseil : si le mode Auto-Measure (mesure automatique) est activé, la mesure du blanc débute automatiquement lorsque vous abaissez le bras. (Cette option n’est pas disponible pour les mesures en cuvettes.)
–Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette.
5. Mesurer l’étalon de référence :
–Pipetez 2 µl de solution de référence sur le socle, ou insérez une cuvette de référence (la solution de référence ne doit contenir aucune des protéines utilisées pour l’étalon ; consultez la rubrique Utilisation des courbes d’étalonnage pour plus de détails).
–Sélectionnez Measure (mesurer) et attendez que la mesure soit terminée.
–Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette.
–Si vous avez défini un nombre de réplicats supérieur à 1, répétez la mesure.
6. Mesurer les autres étalons :
–Pipetez 2 µl d’étalon 1 sur le socle, ou insérez une cuvette d’étalon 1.
–Sélectionnez Measure (mesurer) et attendez que la mesure soit terminée.
–Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette.
–Si vous avez défini un nombre de réplicats supérieur à 1, répétez la mesure.
–Répétez les sous-étapes ci-dessus pour chaque étalon supplémentaire (lorsque le nombre spécifié d’étalons et de réplicats a été analysé, un message s’affiche vous demandant de choisir l’une des options suivantes : mesurer à nouveau les étalons, charger d’autres étalons ou démarrer l’analyse des échantillons).
–Quand vous avez terminé de mesurer les étalons, appuyez soit sur Measure Samples. (mesurer les échantillons) (balayez vers la gauche pour afficher la courbe d’étalonnage) si vous utilisez le logiciel de contrôle local soit sur l’onglet Curve (courbe) si vous utilisez le logiciel de contrôle PC.
7. Mesurer les échantillons :
–Pipetez 2 µl de l’échantillon 1 sur le socle, ou insérez la cuvette d’échantillon 1.
–Sélectionnez Measure (mesurer) et attendez que la mesure soit terminée.
–Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette.
–Si vous avez défini un nombre de réplicats supérieur à 1, répétez la mesure.
8. Lorsque vous avez terminé de mesurer les échantillons, sélectionnez End Experiment (terminer l’expérience).
9. Relevez le bras et nettoyez les deux socles avec une nouvelle lingette de laboratoire, ou retirez la cuvette d’échantillon.
• Utiliser une courbe d’étalonnage
• Bonnes pratiques pour les mesures de protéines
• Mesurer un échantillon micro-volume
• Mesurer un échantillon à l’aide d’une cuvette
• Préparer les échantillons et les blancs
• Fonctionnement de base de l’instrument