Bonnes pratiques pour les mesures de fluorescence

Pour minimiser l’influence d’agents contaminants non testés et pour assurer la plus grande précision d’analyse, il convient d’analyser les étalons dans les mêmes conditions que les échantillons expérimentaux.

Isolez et purifiez les échantillons d’acides nucléiques avant leur analyse pour en retirer  les impuretés. Selon l’échantillon, les impuretés peuvent inclure de l’ADN, de l’ARN, des nucléotides libres, des protéines, certains composants tampons et des colorants. Consultez la rubrique Préparation des échantillons pour plus d’informations.

Assurez-vous que la concentration de l’échantillon se situe dans les limites de l’analyse choisie.

Les performances des kits NanoDrop Ultra Fluorescence sont optimales lorsque toutes les solutions sont conservées à température ambiante (18 à 28°C). Les fluctuations de température peuvent influer sur l’exactitude des analyses.

Assurez-vous que la surface des socles a été correctement nettoyée et conditionnée.

Mélangez au vortex et centrifugez chaque échantillon avant de prendre une mesure. Évitez d’introduire des bulles d’air lors des étapes de mélange et de pipetage.

Suivez les bonnes pratiques pour les mesures de micro-volumes.

Utilisez un volume d’échantillon de 2 µl. Consultez la rubrique Volumes d’échantillon recommandés pour obtenir des informations supplémentaires.

Pour chaque expérience, vous avez la possibilité de créer une nouvelle courbe d’étalonnage ou d’utiliser les valeurs d’une courbe d’étalonnage antérieure. Pour minimiser les variables pouvant impacter les performances, il est fortement recommandé d’effectuer un nouvel étalonnage pour chaque nouvelle analyse.

Aucune donnée n’est actuellement disponible concernant la mutagénicité ou la toxicité des réagents du kit NanoDrop™ Ultra dsDNA BR Fluorescence (colorant du composant A). Ces réactifs se fixent aux acides nucléiques. Traitez les tampons avec les mêmes précautions de sécurité que tous les autres agents mutagènes potentiels et éliminez le colorant conformément aux réglementations locales.

L’application NanoDrop™ Ultra RNA HS Fluorescence comprend des étalons d’ARNr de haute qualité. Pour une performance d’analyse optimale, il est essentiel de maintenir l’intégrité et la concentration de ces étalons. Nous vous recommandons donc vivement de traiter ces étalons d’ARNr avec le même soin que tout autre échantillon d’ARN. Veillez entre autres à :

utiliser des techniques de manipulation sans ARNase, telles que des gants, des pointes de pipette et des tubes sans ARNase ;

garder les tubes de test fermés le plus possible ;

éviter que votre pipette touche la paroi interne du tube lors du prélèvement d’un échantillon.

Après leur utilisation, il est conseillé de mettre sans attendre les étalons d’ARNr au réfrigérateur.

Sujets connexes

Mesurer un échantillon micro-volume

Bonnes pratiques pour les mesures de micro-volumes

Fonctionnement de base de l’instrument

 

Utiliser une courbe d’étalonnage

L’analyse de la fluorescence exige la production d’une courbe d’étalonnage.

Chaque expérience nécessite une courbe d’étalonnage. Vous pouvez créer une nouvelle courbe d’étalonnage ou importer les étalons utilisés lors d’une expérience précédente.

Pour importer une courbe d’étalonnage créée antérieurement, sélectionnez l’option Load standards (charger des étalons) sur l’écran de configuration de l’application, mettez en surbrillance une courbe d’étalonnage précédemment réalisée et appuyez sur Save (enregistrer).

Pour créer une nouvelle courbe d’étalonnage, sélectionnez l’option Setup standards (configurer des étalons) sur l’écran de configuration de l’application. Apportez toutes les modifications nécessaires aux paramètres spécifiques à l’application, puis sélectionnez Save (enregistrer).

.

Remarque  Les analyses de fluorescence NanoDrop Ultra BR et HS Fluorescence nécessitent 2 étalons.

Mesurez tous les étalons avant de commencer l’analyse des échantillons. Une fois que le premier échantillon a été mesuré, il n’est plus possible de modifier la courbe d’étalonnage.

Lorsque vous procédez à l’analyse des étalons, un écran de dialogue apparaît, vous invitant à mesurer les étalons suivants.

CH6_Image_1.png

 

Balayez vers la gauche d’un écran pour afficher la courbe d’étalonnage à mesure de sa création. Un exemple est donné ci-dessous.

CH6_Image_2.png

 

Lorsque vous utilisez l’application Fluorometer, une valeur R2 apparaîtra, indiquant le degré d’alignement de la courbe d’étalonnage avec les points de mesure des étalons (une valeur de 1,0 correspond à un alignement parfait ; tous les points sont situés exactement sur la courbe).

Balayez vers la gauche d’un écran pour afficher le tableau de données des étalons. Un exemple est donné ci-dessous.

CH6_Image_3.png

 

Appuyez sans relâcher sur une ligne dans un quelconque des écrans précédents pour afficher les détails d’un étalon spécifique. Un exemple est donné ci-dessous.

CH6_Image_4.png

 

Une fois les deux étalons mesurés pour le type de courbe sélectionné, un message semblable au suivant s’affiche :

CH6_Image_5.png

 

Remeasure standards (mesurer à nouveau les étalons) : ce bouton renvoie à l’écran de mesure des étalons, sur lequel vous pouvez mesurer à nouveau les étalons qui viennent d’être analysés.

Sur l’écran de la courbe d’étalonnage ou du tableau de données des étalons, appuyez sans relâcher sur la ligne de l’étalon à mesurer de nouveau pour afficher la fenêtre Sample Details (informations sur l’échantillon).

Sélectionnez Remeasure (mesurer à nouveau).

Load more standards (charge d’autres étalons) : renvoie à l’écran de configuration sur lequel vous pouvez ajouter d’autres étalons à mesurer. Au total, 1 échantillon de référence et 7 étalons peuvent être utilisés. Cette option n’apparaîtra pas lorsque vous exécutez les applications dsDNA Fluorescence ou RNA Fluorescence, car ces dernières nécessitent l’utilisation de deux étalons.

Measure samples (mesurer les échantillons) : ce bouton ouvre l’écran de mesure des échantillons.

Remarque  Une fois les deux étalons mesurés, le message « Standards Completed » (mesure des étalons terminée) devrait apparaître. Si le message « Invalid Standards » (étalons non valides) s’affiche une fois que tous les étalons ont été mesurés, mesurez à nouveau les étalons en veillant à utiliser le matériel approprié.