Préparer les échantillons et les blancs
• Isolez et purifiez les échantillons avant de les mesurer avec l’instrument. Vous pouvez, pour ce faire, utiliser un kit d’isolation d’échantillons disponible dans le commerce ou avoir recours à un protocole interne. Après sa purification et avant d’effectuer les mesures, l’analyte d’intérêt est généralement dissous dans une solution tampon aqueuse.
Conseil : toute molécule qui absorbe la lumière à la longueur d’onde de l’analyse contribuera à la valeur d’absorbance totale utilisée pour calculer la concentration de l’échantillon.
• Vérifiez que la concentration finale de l’analyte se situe dans les limites de détection d’absorbance de l’instrument.
• Pour les mesures de micro-volumes, mélangez délicatement (mais minutieusement) chaque échantillon au vortex avant son analyse.
Évitez d’introduire des bulles d’air lors des étapes de mélange et de pipetage.
Remarque Il est possible que les échantillons dissous dans des solvants extrêmement volatiles comme l’hexane nécessitent le mode d’analyse d’échantillons en cuvettes pour des résultats optimaux (instruments NanoDrop Ultra et NanoDrop Ultrac FL uniquement). |
Le tampon utilisé pour mettre en suspension un analyte d’échantillon peut contribuer à l’absorbance. Effectuer le blanc réduit cette augmentation éventuelle de l’absorbance due aux composants du tampon dans la mesure de l’échantillon. Le spectre de l’échantillon ainsi obtenu représente uniquement l’absorbance de l’analyte d’intérêt.
Pour optimiser les résultats :
• Pour la plupart des applications, effectuez le blanc de l’instrument avec la même solution tampon que celle utilisée pour mettre en suspension l’analyte d’intérêt. La solution de blanc doit avoir un pH et une force ionique similaires à ceux de la solution d’analyte.
• Mesurez un nouveau blanc avant d’analyser chaque nouvel ensemble d’échantillons. Il n’est pas nécessaire d’effectuer le blanc de l’instrument avant chaque mesure d’échantillon, sauf si les échantillons sont dissous dans différentes solutions tampons.
• Mesurez un nouveau blanc toutes les 30 minutes.
• Exécutez un cycle à blanc pour vérifier que votre solution de blanc est adéquate avant de l’utiliser pour la mesure des échantillons.
Le spectre résultant ne doit pas varier de plus de 0,02 A ou 0,4 A (équivalant à 10 mm), selon l’application, sur l’ensemble des longueurs d’onde et en particulier à celle utilisée pour l’analyse, comme l’illustre l’exemple ci-dessous.
Si le spectre obtenu varie de plus de 0,02 A ou 0,4 A (équivalant à 10 mm), selon l’application, à la longueur d’onde destinée à l’analyse, la solution en question risque d’interférer avec les analyses d’échantillons, en particulier dans le cas d’échantillons de faible concentration. Reportez-vous aux explications ci-dessous.
Problèmes relatifs au blanc pouvant survenir
• Présence de résidus d’échantillon sur le socle ou dans la cuvette avant la mesure du blanc. (Les spectres d’échantillon obtenus risquent de présenter des valeurs d’absorbance négatives, ce qui indique que l’absorbance du blanc était supérieure à celle de l’échantillon dans cette région du spectre.)
• Absorbance du blanc supérieure à celle de l’échantillon indéterminé à la longueur d’onde d’analyse. (Si la composition du tampon utilisé comme blanc diffère de celle du tampon employé pour mettre l’échantillon en suspension, les résultats de l’analyse seront inexacts.)
• Utilisation accidentelle d’un échantillon pour effectuer le blanc de l’instrument. (Le spectre d’échantillon résultant risque de présenter des valeurs d’absorbance négatives ou, dans certains cas, de ressembler à une image miroir d’un spectre pur typique d’acides nucléiques ou de protéines, comme l’illustre l’exemple ci-dessous.)
Solutions en cas de problèmes de blanc
• Nettoyez et/ou reconditionnez entièrement les deux socles, puis :
–effectuez un nouveau cycle à blanc ; ou
–mesurez un nouveau blanc dérivé d’une nouvelle aliquote de solution tampon appropriée, puis mesurez une nouvelle aliquote d’échantillon indéterminé.
Pour la plupart des applications, effectuez le blanc de l’instrument avec la même solution tampon que celle utilisée pour mettre en suspension l’analyte d’intérêt. La solution de blanc doit avoir un pH et une force ionique similaires à ceux de la solution d’analyte.