Protein BCA

Cette méthode mesure la concentration totale d’échantillons non purifiés de protéines à l’aide d’un réactif de détection colorimétrique à base d’acide bicinchonique.

Mesurer avec la méthode Protein BCA

Résultats rapportés

Paramètres

Limites de détection

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Principe de l’analyse Protein BCA

La méthode Protein BCA repose sur l’utilisation de l’acide bicinchonique (BCA) comme réactif de détection des ions Cu+1, qui se forment lorsque des ions Cu+2 sont réduits par certaines protéines en milieu alcalin. Un produit de réaction violet est formé par la chélation de deux molécules de BCA avec un ion cuivre (Cu+1). Le chélate de Cu-BCA qui se forme en présence de protéines est mesuré à 562 nm et corrigé pour la ligne de base en utilisant la valeur d’absorbance à 750 nm. Vous pouvez vous procurer des kits préformulés de réactif BCA et de CuSO4 chez Thermo Scientific ou auprès d’un distributeur local.

Kits et protocoles d’analyse des protéines

Veuillez consulter le site Web de NanoDrop pour connaître les derniers kits et protocoles pour instruments NanoDrop Ultra. Suivez les recommandations du fabricant du kit d’analyse pour la manipulation de tous les étalons et échantillons (non déterminés). Veillez à traiter chacun d’entre eux dans les mêmes délais et à la même température tout au long de l’analyse.

Les étalons de protéines servant à créer une courbe d’étalonnage peuvent également être fournis par le fabricant du kit. Étant donné que les socles du NanoDrop Ultra peuvent mesurer des concentrations de protéines plus élevées que les spectrophotomètres à cuvette traditionnels, vous devrez éventuellement fournir vos propres étalons de protéines dont les concentrations seront plus fortes que celles du fabricant. Par exemple, il peut s’avérer nécessaire d’utiliser des étalons supplémentaires pour que la courbe d’étalonnage couvre la gamme de mesures dynamique de l’analyse et la plage attendue des valeurs des échantillons à déterminer.

Utiliser une courbe d’étalonnage

L’analyse colorimétrique de protéines nécessite une courbe d’étalonnage.

Chaque expérience nécessite une courbe d’étalonnage. Vous pouvez créer une nouvelle courbe d’étalonnage ou importer les étalons utilisés lors d’une expérience précédente.

Pour importer une courbe d’étalonnage créée antérieurement, sélectionnez l’option Load Standards (charger des étalons) sur l’écran de configuration de l’application, choisissez une des courbes d’étalonnage existantes disponibles et appuyez sur Save (enregistrer).

Préparez les étalons et les échantillons indéterminés de la même manière. Consultez les consignes et les recommandations du fabricant du kit.

Toutes les solutions de référence et d’étalonnage doivent être préparées dans le même tampon que celui ayant servi à mettre les échantillons en suspension. On y ajoutera le même volume de mélange réactif que celui ajouté aux échantillons.

Le premier étalon sert à réaliser une mesure de référence. The reference solution should contain none of the analyte of interest. (Une mesure de référence n’est pas une mesure de blanc. Cette application nécessite ces deux valeurs.)

La plage de concentration des étalons doit couvrir la gamme de mesures dynamique de l’analyse et la plage attendue des valeurs des échantillons à déterminer. Les concentrations d’analytes présents dans les échantillons ne sont pas extrapolées au-delà de la concentration du plus grand étalon.

Ouvrez la fenêtre Setup Standards (configurer des étalons) sur l’écran de configuration de l’application pour saisir les valeurs de concentration des étalons et préciser les paramètres d’analyse des étalons et des échantillons (nombre de réplicats, type de courbe, etc.).

Selon le type de courbe défini, il est possible de créer une courbe d’étalonnage à partir de deux étalons ou plus.

Le logiciel nécessite une mesure de référence et permet de mesurer jusqu’à sept étalons.

Les valeurs de concentration des étalons peuvent être saisies dans n’importe quel ordre tant que les étalons sont mesurés dans l’ordre dans lequel ils ont été saisis. Les bonnes pratiques suggèrent cependant de mesurer les étalons de la concentration d’analyte d’étalonnage la plus basse à la plus haute.

Pour toutes les analyses colorimétriques, à l’exception de la méthode Protein Pierce 660, effectuez le blanc de l’instrument avec de l’H2O DI (eau déionisée). Pour la méthode Protein Pierce 660, effectuez le blanc avec la solution de référence (voir ci-dessous).

Mesurez la solution de référence et tous les étalonsavant de commencer l’analyse des échantillons. Une fois que le premier échantillon a été mesuré, il n’est plus possible de modifier la courbe d’étalonnage.

Lorsque vous procédez à l’analyse des étalons, un écran de mesure apparaît, similaire aux écrans de mesure des échantillons.

Lorsque vous utilisez le logiciel de contrôle PC, appuyez sur l’onglet Curve (courbe) pour afficher la courbe d’étalonnage à mesure de sa création.

La valeur R2 indique le degré d’alignement de la courbe d’étalonnage avec les points de mesure des étalons (une valeur de 1,0 correspond à un alignement parfait ; tous les points sont situés exactement sur la courbe).

 

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Une fois que vous avez mesuré le nombre minimum d’étalons requis pour le type de courbe sélectionné, un message semblable au suivant s’affiche :

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Remeasure standards (mesurer à nouveau les étalons) : ce bouton renvoie à l’écran de mesure des étalons, sur lequel vous pouvez mesurer à nouveau les étalons qui viennent d’être analysés.

Sur l’écran de mesure des étalons, de la courbe d’étalonnage ou du tableau de données des étalons, appuyez sans relâcher sur la ligne pour afficher la fenêtre Sample Details (informations sur l’échantillon).

Sélectionner Remeasure (mesurer à nouveau) puis appuyez sur Yes (oui) pour confirmer.

Load more standards (charge d’autres étalons): ce bouton renvoie à l’écran de configuration sur lequel vous pouvez ajouter ou modifier des valeurs de concentration d’un quelconque étalon, avant d’appuyer sur Save (enregistrer) pour procéder à l’analyse. Cette option ne sera pas disponible si vous avez déjà mesuré la quantité maximale autorisée d’étalons.

Measure samples (mesurer les échantillons) : appuyez sur ce bouton pour ouvrir l’écran de mesure des échantillons. À partir de ce moment, il n’est plus possible de modifier les étalons.

Remarque  Vous pouvez ajouter, modifier ou supprimer un étalon à tout moment avant de sélectionner la fonction Measure Samples (mesurer les échantillons).

Ajouter un étalon :

Sur l’écran de mesure des étalons, appuyez sur Settings_Gear00100.png.

Sélectionnez le prochain champ « Concentration » vide et saisissez la valeur de concentration du nouvel étalon.

Appuyez sur Save (enregistrer).

Modifier un étalon :

Sur l’écran de mesure des étalons, appuyez sur Settings_Gear00101.png.

Sélectionnez le champ « Concentration » approprié et modifiez la valeur de la concentration.

Appuyez sur Save (enregistrer).

Supprimer un étalon :

Sur l’écran de mesure des étalons, de la courbe d’étalonnage ou du tableau de données des étalons, appuyez sans relâcher sur la ligne pour afficher la fenêtre Standard Details (informations sur l’étalon).

Appuyez sur Trash_icon00102.png.

Appuyez sur Yes (oui) pour confirmer.

L’étalon ne figure plus au tableau sur l’écran de mesure et sa valeur de concentration n’apparaît plus sur l’écran de configuration.

Remarque  Vous pouvez utiliser cette méthode pour supprimer la mesure de référence mais vous devrez mesurer un nouvel échantillon de référence immédiatement.

AUne fois que vous avez mesuré tous les étalons pour le type de courbe sélectionné, le message « Standards Completed » (analyse des étalons terminée) s’affichera.Si vous voyez s’afficher le message « Invalid Standards » (étalons non valides) après avoir mesuré tous les étalons saisis, essayez les actions suivantes :

sélectionner un type de courbe différent ;

Mesurer à nouveau les étalons en veillant à utiliser le matériel d’étalonnage adéquat.

Remarque  Ce message indique uniquement que le nombre minimum de points requis a été établi pour le type de courbe sélectionné. IIl ne signifie pas que l’intégrité de la courbe a été validée. Par exemple, il peut être nécessaire d’ajouter des étalons supplémentaires pour couvrir toute la plage des concentrations attendue de l’analyse.