Comme pour les autres applications pour acides nucléiques, les applications Oligo s’appuient sur l’équation de Beer-Lambert pour établir une corrélation entre absorbance et concentration d’après le coefficient d’extinction et la longueur du trajet optique de l’échantillon. Étant donné que les oligonucléotides sont de courtes molécules à simple brin (ou des molécules plus longues à séquences répétées), leur spectre et coefficient d’extinction (e) dépendent étroitement de la composition et de la séquence de leurs bases. (Les coefficients d’extinction et les facteurs généralement acceptés pour l’ADN à simple brin et l’ARN fournissent des estimations qui sont raisonnablement proches des concentrations de séquences naturelles, essentiellement randomisées, mais pas de celles de séquences courtes d’oligonucléotides synthétisés.) Afin d’obtenir les résultats les plus précis possibles, nous utilisons la valeur exacte de e260 pour calculer les concentrations d’oligonucléotides. Le logiciel NanoDrop vous permet de spécifier la séquence des bases d’un oligonucléotide avant qu’il ne soit mesuré. Pour toute séquence de bases saisie, le logiciel applique l’équation ci-contre pour calculer le coefficient d’extinction. |
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Coefficients d’extinction pour les oligonucléotides Le logiciel exploite la méthode du plus proche voisin et la formule suivante pour calculer les coefficients d’extinction molaires de séquences de bases d’oligonucléotides spécifiques : ![]()
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Conseil : le coefficient d’extinction est spécifique à la longueur d’onde pour chaque oligonucléotide et peut être influencé par le type de tampon, la force ionique et le pH de l’échantillon. |
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Les concentrations d’acides nucléiques sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à 260 nm, du facteur utilisé et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base (ou correction d’analyse) à partir d’un seul point. La concentration est rapportée en unités de masse. Vous trouverez sur Internet des calculateurs conçus pour convertir une concentration exprimée en masse en unités molaires en fonction de la séquence de l’échantillon. Des valeurs d’absorbance à 260 nm, 280 nm et parfois 230 nm sont utilisées pour calculer les rapports de pureté des échantillons d’acides nucléiques mesurés. Les rapports de pureté sont sensibles à la présence de contaminants dans l’échantillon, tels que les solvants et les réactifs résiduels typiquement utilisés lors de la purification de l’échantillon.
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Valeurs mesurées Remarque : les spectres d’absorbance des échantillons micro-volumes et des échantillons en cuvettes non classiques (autres que celles de 10 mm) sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.
• Les valeurs d’absorbance d’acide nucléique sont mesurées à 260 nm en utilisant le spectre normalisé. Il s’agit de la valeur A260 rapportée si la correction de ligne de base n’est pas sélectionnée. • Si l’option Baseline Correction (correction de ligne de base) est sélectionnée, la valeur d’absorbance à la longueur d’onde de correction est soustraite à celle de l’absorbance de l’échantillon à 260 nm. L’absorbance corrigée à 260 nm est rapportée et sert calculer la concentration d’acides nucléiques. Absorbance A230, A280 • les valeurs d’absorbance normalisées à 230 nm, 260 nm et 280 nm sont utilisés pour calculer les rapports A260/A230 et A260/A280. |
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Longueur du trajet optique de l’échantillon • Pour les mesures de micro-volumes, le logiciel sélectionne la longueur de trajet optique optimale (entre 1,0 mm et 0,03 mm) en fonction de l’absorbance de l’échantillon à la longueur d’onde d’analyse. • Les mesures en cuvettes utilisent la longueur de trajet optique sélectionnée après l’activation du mode cuvette (voir Paramètres des cuvettes). • Les spectres et les valeurs d’absorbance affichés sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm. |
Les cinq nucléotides qui constituent l’ADN et l’ARN présentent des rapports A260/A280 très différents. Les rapports A260/A280 estimés pour chaque nucléotide mesuré indépendamment sont fournis ci-dessous : Guanine : 1,15 Le rapport A260/A280 d’une séquence d’acides nucléiques spécifique est approximativement égal à la moyenne pondérée des rapports A260/A280 des quatre nucléotides qui la composent. Remarque : l’ARN aura généralement un rapport 260/280 plus élevé en raison du rapport supérieur de l’uracile par rapport à celui de la thymine. |
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• Concentration d’acides nucléiques. Rapportée dans l’unité sélectionnée (c.-à-d. ng/µl, µg/ul ou µg/ml). Les calculs sont effectués en appliquant la loi de Beer modifiée et se fondent sur la valeur d’absorbance des acides nucléiques corrigée.
• Rapport de pureté A260/A280. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 280 nm. • Rapport de pureté A260/A230. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 230 nm. Remarque : les rapports de pureté traditionnels (A260/A280 et A260/A230), qui indiquent la présence de divers contaminants dans les échantillons d’acides nucléiques, sont inefficaces pour les oligonucléotides dont la forme des spectres est fortement influencée par leurs composition en bases. Consultez la barre latérale pour plus d’informations. |
• Calculs pour les mesures d’acides nucléiques