Analyse des contaminants

Dans le cas des applications dsDNA, RNA et Protein A280, le logiciel NanoDrop Ultra initie automatiquement une analyse spectrale pour plusieurs contaminants connus au cours de la mesure. Certains des contaminants identifiables sont décrits ci-dessous :

Pour les mesures d’ADNdb et d’ARN :

dans la région d’analyse : protéines et phénol ;

détection de chlorhydrate de guanidine (GHCl) et d’isothiocyanate de guanidinium (GITC) ;

détection d’une contamination par de l’ADNdb spécifique à certaines éspèces dans des échantillons d’ARN et détection d’une contamination par de l’ARN spécifique à certaines éspèces dans des échantillons d’ADNdb.

Pour les mesures de protéines :

dans la région d’analyse : acides nucléiques et phénol ;

Si des contaminants sont identifiés dans un échantillon, l’icône « Analyse des contaminants » image13400330.jpg apparaît à gauche des résultats de mesure.

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Appuyez sur l’icône pour afficher l’analyse des contaminants et les informations associées.

L’exemple ci-dessous présente les résultats d’une analyse des contaminants dans un échantillon d’acides nucléiques. La quantité de protéines contaminantes est suffisante pour influer sur les résultats des mesures.

 

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1 Calculée d’après l’absorbance totale de l’échantillon (échantillon plus contaminant)

2 Calculée d’après l’absorbance corrigée de l’échantillon (échantillon moins contaminant)

Étant donné que les protéines absorbent la lumière à proximité des longueurs d’onde d’analyse pour les acides nucléiques (230 nm, 260 nm et 280 nm), la présence de protéines dans l’échantillon d’acides nucléiques ci-dessus a fait sortir les rapports A260/A280 et A260/A230 de leur plage et entraîné la détection d’une concentration en acides nucléiques supérieure à sa valeur réelle. Le logiciel est capable d’identifier les impuretés (protéines) et de produire les données suivantes :

absorbance due aux protéines corrigée pour la ligne de base (0,18) à la longueur d’onde d’analyse (260 nm) ;

% de coefficient de variation (CV) pour le résultat de la mesure (incertitude x 100/résultat de mesure = 14,03 % ; un % de CV élevé indique que le résultat de la mesure est proche de la limite de détection de l’instrument ou qu’un composant interférent est présent) ;

concentration en acides nucléiques initiale (59,5 ng/µl), fondée sur l’absorbance totale corrigée pour la ligne de base (échantillon plus contaminant) à la longueur d’onde d’analyse ;

concentration en acides nucléiques corrigée (49,5 ng/µl), fondée sur l’absorbance corrigée (échantillon moins contaminant) à la longueur d’onde d’analyse.

Principe de l’analyse des contaminants

Les mesures d’absorbance UV et UV-visible servent à quantifier les échantillons d’acides nucléiques et de protéines à 260 nm et 280 nm, respectivement. L’analyse repose sur le fait que l’absorbance totale d’une solution mixte à une longueur d’onde donnée est égale à la somme des valeurs d’absorbance des différents composants du mélange.

Cette méthode présente néanmoins un désavantage récurrent : de nombreux produits utilisés lors du processus d’extraction peuvent absorber la lumière dans diverses régions du spectre. Lorsque ces contaminants sont présents dans un échantillon, ils peuvent interférer avec l’analyse en augmentant artificiellement l’absorbance à la longueur d’onde d’intérêt, ce qui résulte en une surestimation de la concentration en analytes.

Pour détecter la présence de contaminants susceptibles d’influer sur les applications en aval, les opérateurs ont pris l’habitude de calculer les rapports de pureté. Ces rapports de pureté, pourtant, ne fournissent pas toujours un tableau complet de la contamination potentielle d’un échantillon. Lorsqu’un rapport de pureté sort de la plage attendue, le profil spectral correspondant est généralement examiné de manière qualitative.

Notre technologie Acclaro applique une approche quantitative à l’analyse des contaminants. Le système Acclaro exploite des algorithmes mathématiques sophistiqués qui analysent les données spectrales afin d’identifier les contaminants probables dans un échantillon et de soustraire leur contribution aux résultats de l’échantillon. Il en découle une valeur de concentration plus précise de l’analyte d’intérêt et une analyse davantage quantitative du niveau de contamination.

Étant donné que le spectre d’un composé pure est unique à ce dernier, le spectre d’une solution de plusieurs composés pour la plupart connus et qui interagissent fe façon minimale peut être décomposé mathématiquement en chacun des spectres des composés qui constitue l’échantillon, et ces derniers peuvent être identifiés. L’algorithme d’analyse des contaminants est réglé sur une région spectrale étroite (220 à 285 nm) comprise de part et d’autre de la longueur d’analyse (260 nm pour les acides nucléiques, 280 nm pour les protéines) afin de déterminer toute contribution à l’absorbance d’éventuels contaminants connus (protéines ou acides nucléiques, et phénol) qui absorbent dans cette région. L’ensemble du spectre est analysé pour déterminer la présence d’autres contaminants possibles tels que le chlorhydrate de guanidine (GHCl) et/ou l’isothiocyanate de guanidinium (GITC), qui sont des réactifs courants utilisés pour la purification des acides nucléiques.

Remarque Obtenir des résultats d’analyse de contaminants cohérents et de haute qualité dépend de la qualité des spectres d’échantillon mesurés, qui est elle-même fonction du bon fonctionnement de l’instrument. Pour plus d’informations, consultez la rubrique Calendrier d’entretien.