Calculs

Comme pour les autres applications pour acides nucléiques, l’application Protein A205 s’appuie sur l’équation de Beer-Lambert pour établir une corrélation entre absorbance et concentration d’après le coefficient d’extinction et la longueur du trajet optique de l’échantillon.

Cette application propose trois options (indiquées ci-contre) pour sélectionner un coefficient d’extinction approprié à chaque échantillon mesuré, qui sera intégré à l’équation de la loi de Beer afin de déduire la concentration de l’échantillon respectif.

Si vous connaissez le coefficient d’extinction de l’échantillon, choisissez l’option e1 % (masse) et saisissez sa valeur. Dans le cas contraire, calculez le coefficient d’extinction ou choisissez l’option qui correspond le mieux à la solution d’échantillon.

Conseil : il est préférable que le coefficient d’extinction soit déterminé de manière empirique à l’aide d’une solution de la protéine à l’étude dont la concentration est connue et diluée dans le même tampon.

 

Options disponibles pour le coefficient d’extinction

31, suppose une0,1 % (1 mg/ml) à 205 nm = 31

Champs d’application, suppose e0,1 % (1 mg/ml) à 205 nm = 27 + 120 * (A280/A205)

Autre protéine, saisir le coefficient d’extinction de masse en l/gm-cm pour une solution de protéines à 1 mg/ml (e0,1 %)

Remarque : consultez la rubrique Type d’échantillon pour plus d’informations.

Valeurs mesurées

Absorbance A205

Remarque : les spectres d’absorbance des échantillons micro-volumes et des échantillons en cuvettes non classiques (autres que celles de 10 mm) sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.

 

Les valeurs d’absorbance des protéines sont mesurées
à 205 nm en utilisant le spectre normalisé. Si la correction de ligne de base n’est pas sélectionnée, il s’agit de la valeur A205 rapportée et de la valeur utilisée pour calculer la concentration de protéines.

Si l’option Baseline Correction (correction de ligne de base) est sélectionnée, la valeur d’absorbance à 205 nm normalisée et corrigée pour la ligne de base est rapportée et utilisée pour calculer la concentration de protéines.

Absorbance A280

La valeur d’absorbance à 280 nm normalisée et corrigée pour la ligne de base (le cas échéant) est également rapportée.

Les concentrations de protéines sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à 205 nm, du coefficient d’extinction sélectionné (ou saisi) et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base à partir d’un seul point.

La concentration est rapportée en unités de masse. Vous trouverez sur Internet des calculateurs conçus pour convertir une concentration exprimée en masse en unités molaires en fonction de la séquence de l’échantillon.

 

 

 

Longueur du trajet optique de l’échantillon

Pour les mesures de micro-volumes, le logiciel sélectionne la longueur de trajet optique optimale (entre 1,0 mm et 0,03 mm) en fonction de l’absorbance de l’échantillon à la longueur d’onde d’analyse.

Les mesures en cuvettes utilisent la longueur de trajet optique sélectionnée après l’activation du mode cuvette (voir Paramètres des cuvettes).

Les spectres et les valeurs d’absorbance affichés sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.

 

 

 

Valeurs rapportées

Concentration des protéines. Rapportée dans l’unité sélectionnée (mg/ml ou µg/ml). Les calculs sont effectués en appliquant l’équation de Beer-Lambert et se fondent sur la valeur d’absorbance corrigée des protéines.

Méthode. Détermine le coefficient d’extinction à utiliser en complément de la loi de Beer pour calculer la concentration de l’échantillon.

Baseline Correction (correction de ligne de base). Longueur d’onde sélectionnée pour la correction de ligne de base et absorbance détectée à cette longueur d’onde.

Position. Indique si la mesure a été réalisée sur le socle ou en cuvette.

Longueur d’onde évaluée. Permet de saisir une longueur d’onde supplémentaire dont vous souhaitez inclure la valeur d’absorbance dans le rapport.

Coefficient d’extinction de masse
(solution à 1 %).

 

 

 

Agitateur. « Off » s’affiche lorsque l’option d’agitation  pour un modèle de cuvettes n’est pas utilisée. Lorsque l’agitateur est activé, la vitesse d’agitation est affichée.

Circuit thermique. « Off » ou « On » s’affiche pour indiquer si le porte-cuvette a été chauffé pendant la mesure.

Température mesurée. La température du porte-cuvette  pendant la mesure s’affiche.

Température cible. Affiche la température souhaitée du porte-cuvette.