Les applications pour acides nucléiques s’appuient sur une version modifiée de l’équation de Beer-Lambert (illustrée ci-contre) pour calculer la concentration de l’échantillon selon un « facteur » qui correspond au coefficient d’extinction et à la longueur du trajet optique combinés. |
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Coefficients d’extinction et facteurs Sur base des termes de l’équation de Beer-Lambert, le facteur (f) est défini comme suit : facteur (f) = 1/(e * b) Où : Par conséquent, la concentration de l’analyte (c) est calculée comme suit : c = A * [1/(e * b)] ou c = A * f Où : |
Dans le cas des applications dsDNA, ssDNA et RNA, les facteurs généralement acceptés pour les acides nucléiques sont utilisés en complément de la loi de Beer pour calculer la concentration des échantillons. L’application Custom Factor (facteur personnalisé) utilise un facteur spécifié par l’utilisateur. |
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• ADNdb (facteur = 50 ng-cm/µl) • ADNsb (facteur = 33 ng-cm/µl) • ARN (facteur = 40 ng-cm/µl) • Facteur personnalisé (facteur compris entre 15 ng-cm/µl et 150 ng-cm/µl saisi par l’utilisateur). |
Les concentrations d’acides nucléiques sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à 260 nm, du facteur utilisé et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base (ou correction d’analyse) à partir d’un seul point. La concentration est rapportée en unités de masse. Vous trouverez sur Internet des calculateurs conçus pour convertir une concentration exprimée en masse en unités molaires en fonction de la séquence de l’échantillon. Des valeurs d’absorbance à 260 nm, 280 nm et parfois 230 nm sont utilisées pour calculer les rapports de pureté des échantillons d’acides nucléiques mesurés. Les rapports de pureté sont sensibles à la présence de contaminants dans l’échantillon, tels que les solvants et les réactifs résiduels typiquement utilisés lors de la purification de l’échantillon.
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Valeurs mesurées Remarque : les spectres d’absorbance des échantillons micro-volumes et des échantillons en cuvettes non classiques (autres que celles de 10 mm) sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.
• Les valeurs d’absorbance des acides nucléiques sont mesurées à 260 nm en utilisant le spectre normalisé. Il s’agit de la valeur A260 rapportée si la correction de ligne de base n’est pas sélectionnée. • Si l’option Baseline Correction (correction de ligne de base) est sélectionnée, la valeur d’absorbance à la longueur d’onde de correction est soustraite à celle de l’absorbance à 260 nm. L’absorbance corrigée à 260 nm est rapportée et sert à calculer la concentration d’acides nucléiques. • les valeurs d’absorbance à 230 nm et 280 nm normalisées et corrigées pour la ligne de base (le cas échéant) sont utilisées pour calculer les rapports A260/A230 et A260/A280. |
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Longueur du trajet optique de l’échantillon • Pour les mesures de micro-volumes, le logiciel sélectionne la longueur de trajet optique optimale (entre 1,0 mm et 0,03 mm) en fonction de l’absorbance de l’échantillon à la longueur d’onde d’analyse. • Les mesures en cuvettes exploitent la longueur de trajet optique sélectionnée après l’activation du mode d’analyse en cuvettes. (voir Paramètres des cuvettes) • Les spectres et les valeurs d’absorbance affichés sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.
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• Concentration d’acides nucléiques. Rapportée dans l’unité sélectionnée (c.-à-d. ng/µl, µg/ul ou µg/ml). Les calculs sont effectués en appliquant la loi de Beer modifiée et se fondent sur la valeur d’absorbance des acides nucléiques corrigée.
• Rapport de pureté A260/A280. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 280 nm. Il est généralement accepté qu’un rapport de pureté A260/A280 d’environ 1,8 indique un échantillon d’ADN pur (~2,0 pour l’ARN). Les solutions acidiques peuvent sous-représenter la valeur rapportée par 0,2-0,3 ; l’inverse est vrai pour les solutions basiques.
• Rapport de pureté A260/A230. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 230 nm. Il est généralement accepté que des rapports de pureté A260/A230 d’environ 1,8 et 2,2 indiquent respectivement des échantillons d’ADN pur et d’ARN pur. Remarque : si les rapports de pureté sont des indicateurs importants de la qualité des échantillons d’ADN ou d’ARN, la meilleure façon de vérifier leur qualité est d’évaluer leurs performances dans l’application subséquente d’intérêt (p. ex., analyse PCR en temps réel). • Facteur. Utilisé en complément de la loi de Beer pour calculer la concentration de l’échantillon. • Contaminant - Si un contaminant a été détecté par le logiciel Acclaro, il sera affiché dans cette colonne. • Facteur. Utilisée en complément de la loi de Beer pour calculer la concentration de l’échantillon. • Correction de ligne de base. Longueur d’onde sélectionnée pour la correction de ligne de base et absorbance détectée à cette longueur d’onde. • Position. Indique si la mesure a été réalisée sur le socle ou en cuvette. • Longueur d’onde évaluée. Permet de saisir une longueur d’onde supplémentaire dont vous souhaitez inclure la valeur d’absorbance dans le rapport. |
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• Contaminant. Si un contaminant a été détecté par le logiciel Acclaro, il sera affiché dans cette colonne. • Corrigé. Affiche la concentration d’analyte corrigée , déterminée à l’aide du logiciel Acclaro, le cas échéant. • Species. Espèce du contaminant dans la solution d’acides nucléiques détecté par le logiciel Acclaro • Nom du kit. Indique le nom du kit de qPCR utilisé pour déterminer les calculs de réaction de qPCR, si un tel kit a été sélectionné pendant la configuration. • Taux de dilution de l’échantillon. Si une dilution de l’échantillon est recommandée avant la réaction de qPCR, affiche le volume de l’échantillon mesuré par rapport au volume final de la dilution. • Dilution requise : volume de la solution d’acides nucléiques (µl). Si une dilution de l’échantillon est recommandée avant la réaction de qPCR, affiche le volume de l’échantillon d’acides nucléiques de départ à ajouter au tube de dilution. • Dilution requise : volume du diluant (µl). Si une dilution de l’échantillon est recommandée avant la réaction de qPCR, affiche le volume du diluant à ajouter au tube de dilution. • Réaction du kit : volume d’acides nucléiques (µl). S’il est indiqué à la section Dilution Required qu’une dilution n’est pas nécessaire, indique le volume de solution d’acides nucléiques de départ à ajouter au tube de réaction qPCR. S’il est indiqué à la section Dilution Required qu’une dilution est requise, indique le volume de solution diluée d’acides nucléiques à ajouter au tube de réaction qPCR. • Réaction du kit : volume d’eau (µl). Affiche le volume d’eau à ajouter au tube de réaction qPCR. • Réaction du kit : conc. finale des matrices. Affiche la concentration de l’échantillon d’acides nucléiques après son ajout au tube de réaction qPCR. |
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• Agitateur. « Off » s’affiche lorsque l’option d’agitation pour un modèle de cuvettes n’est pas utilisée. Lorsque l’agitateur est activé, la vitesse d’agitation est affichée. • Circuit thermique. « Off » ou « On » s’affiche pour indiquer si le porte-cuvette a été chauffé pendant la mesure. • Température mesurée. Affiche la température du porte-cuvette pendant la mesure. • Température cible. Affiche la température souhaitée du porte-cuvette. |