Cette méthode mesure la concentration totale en protéines d’échantillons de protéines non purifiés à l’aide d’un agent de détection colorimétrique à base de bleu de Coomassie. |
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Principe de l’analyse Protein Bradford
La méthode Protein Bradford repose sur le décalage de l’absorbance du colorant bleu de Coomassie en présence de protéines pour déterminer la concentration totale en protéines d’un échantillon. Le colorant se lie aux protéines et les complexes ainsi formés sont mesurés à 595 nm et corrigés pour la ligne de base d’après la valeur d’absorbance à 750 nm. Vous trouverez des kits préformulés proposant un mélange stabilisé de colorant bleu de Coomassie, d’alcool et d’un tensio-actif en vente chez Thermo Scientific ou auprès d’un distributeur local.
Pour optimiser la fiabilité de la méthode Protein Bradford :
• Réalisez le test promptement et utilisez les étalons et les échantillons préparés dans les plus brefs délais. Les agrégats colorant-colorant et colorant-protéine peuvent former des particules au fil du temps et conduire à des fluctuations importantes dans les valeurs d’absorbance.
• Mesurez les étalons et des échantillons en triple exemplaire, utilisant une nouvelle aliquote pour chaque analyse. Dans le cas des mesures sur socle, la valeur d’absorbance de l’analyte entier (colorant-protéine) à 595 nm ne dépassera pas 0 à 0,150 A environ, compte tenu de la longueur du trajet optique du socle (1,0 mm), de la concentration du bleu de Coomassie et du pH acidique de la solution.
Remarque Si vous disposez du modèle d’instrument NanoDrop UltraC ou NanoDrop UltraC FL, utilisez l’option d’analyse en cuvettes pour obtenir un signal d’absorbance plus élevé. |
Kits et protocoles d’analyse des protéines
Veuillez consulter le site Web de NanoDrop pour connaître les derniers kits et protocoles pour instruments NanoDrop Ultra. Suivez les recommandations du fabricant du kit d’analyse pour la manipulation de tous les étalons et échantillons (non déterminés). Veillez à traiter chacun d’entre eux dans les mêmes délais et à la même température tout au long de l’analyse.
Les étalons de protéines servant à créer une courbe d’étalonnage peuvent également être fournis par le fabricant du kit. Étant donné que les socles du NanoDrop Ultra peuvent mesurer des concentrations de protéines plus élevées que les spectrophotomètres à cuvette traditionnels, vous devrez éventuellement fournir vos propres étalons de protéines dont les concentrations seront plus fortes que celles du fabricant. Par exemple, il peut s’avérer nécessaire d’utiliser des étalons supplémentaires pour que la courbe d’étalonnage couvre la gamme de mesures dynamique de l’analyse et la plage attendue des valeurs des échantillons à déterminer.
Courbes d’étalonnage pour l’application Protein Bradford
L’analyse colorimétrique de protéines nécessite une courbe d’étalonnage.
• Chaque expérience nécessite une courbe d’étalonnage. Vous pouvez créer une nouvelle courbe d’étalonnage en sélectionnant l’option Setup Standards (configurer les étalons) ou importer les étalons utilisés lors d’une expérience précédente en sélectionnant l’option Load Standards (charger des étalons) sur l’écran de configuration de l’application.
Pour plus d’informations, consultez la rubrique Utilisation des courbes d’étalonnage.