Calculs

L’application Protein A280 Pro s’appuie sur l’équation de Beer-Lambert pour corréler l’absorbance avec la concentration. Résoudre la loi de Beer pour la concentration donne lieu à l’équation ci-contre.

 

 

Équation de Beer-Lambert (résolue pour la concentration)

c = A / (e * b)

où :

A = absorbance UV en unités d’absorbance (AU)

e = absorptivité (ou coefficient d’extinction) molaire dépendant de la longueur d’onde en litres/mol-cm

b = longueur du trajet optique en cm

c = concentration de l’analyte en moles/litre ou molarité (M)

Remarque : diviser l’absorbance mesurée d’une solution d’échantillon par son coefficient d’extinction molaire donne la concentration molaire de l’échantillon. Consultez la rubrique Coefficients d’extinction publiés pour plus d’informations sur la différence entre valeurs de concentration molaire et massique.

 

Le coefficient d’extinction d’un peptide ou d’une protéine est lié à sa composition en acides aminés tryptophane (W), tyrosine (Y) et cystéine (C).

Conseil : le coefficient d’extinction est spécifique à la longueur d’onde pour chaque protéine et peut être influencé par le type de tampon, la force ionique et le pH de l’échantillon.

 

Coefficients d’extinction pour les protéines

À 280 nm, le coefficient d’extinction est estimé de façon approximative par la somme pondérée des coefficients d’extinction molaire à 280 nm de ces trois acides aminés, comme illustré par l’équation ci-dessous :

e = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125)

Où :
e = coefficient d’extinction molaire
n = nombre de chaque résidu d’acide aminé
5 500, 1 490 et 125  = absorptivités molaires des acides aminés à 280 nm

Cette application propose six options (indiquées ci-contre) pour sélectionner un coefficient d’extinction approprié à chaque échantillon mesuré, qui sera intégré à l’équation de la loi de Beer afin de déduire la concentration de l’échantillon respectif.

Si vous connaissez le coefficient d’extinction de l’échantillon, choisissez l’option e + MW (molaire) ou e1 % (masse) et saisissez sa valeur. Dans le cas contraire, calculez le coefficient d’extinction ou choisissez l’option qui correspond le mieux à la solution d’échantillon.

Conseil : il est préférable que le coefficient d’extinction soit déterminé de manière empirique à l’aide d’une solution de la protéine à l’étude dont la concentration est connue et diluée dans le même tampon.

 

 

Options disponibles pour le coefficient d’extinction

1 Abs = 1 mg/ml, où le type d’échantillon et/ou le coefficient d’extinction est inconnu (fournit une estimation approximative de la concentration en protéines)

BSA (albumine sérique bovine, 6,7 l/gm-cm)

IgG (tout anticorps de mammifère, 13,7 l/gm-cm)

Lysozyme (lysozyme de blanc d’oeuf, 26,4 l/gm-cm)

Autre protéine (e + MW), coefficient d’extinction molaire défini par l’utilisateur

Autre protéine (e1 %), coefficient d’extinction de masse défini par l’utilisateur

Remarque : consultez la rubrique Type d’échantillon pour plus d’informations.

 

La plupart des sources publiées rapportent des coefficients d’extinction dérivés de protéines mesurées à 280 nm ou à une longueur d’onde proche et préparées dans du phosphate ou un autre tampon physiologique. Ces valeurs fournissent une précision suffisante pour les évaluations courantes de concentration des protéines.

 

Coefficients d’extinction publiés

Les coefficients d’extinction publiés pour les protéines peuvent être présentés comme suit :

absorptivité (ou coefficient d’extinction) molaire spécifique à la longueur d’onde (e) en M-1cm-1

coefficient d’extinction d’une solution en pourcentage (e1 %) avec des unités de (g/100 ml)-1cm-1 (c.-à-d. solution de 1 % ou 1 g/100 ml mesurée dans une cuvette de 1 cm)

valeurs d’absorbance des protéines dans des solutions de 0,1 % (c.-à-d. 1 mg/ml)

Conseil : étudiez soigneusement les valeurs publiées pour appliquer correctement l’unité de mesure pertinente.

L’équation de droite montre la relation entre le coefficient d’extinction molaire (emolaire) et le coefficient d’extinction en pourcentage (e1 %).

 

Conversions entre emolaire et e1 %

(emolaire) * 10 = (e1 %) * (MWprotéine)

Exemple : pour déterminer le coefficient d’extinction d’une solution en pourcentage (e1 %) pour une protéine qui a un coefficient d’extinction molaire de 43 824 M-1cm-1 et un poids moléculaire (MW) de 66 400 daltons (Da), l’équation ci-dessus est réorganisée et résolue comme suit :

e1 % = (emolaire * 10) / (MWprotéine)

e1 % = (43 824 * 10) / 66 400 Da)

e1 % = 6,6 g/100 ml

Pour déterminer la concentration (c) d’un échantillon en mg/ml, utilisez l’équation ci-contre et un facteur de conversion de 10.

Conseil : le logiciel NanoDrop Ultra utilise le facteur de conversion lorsqu’il présente les concentrations de protéines.

 

Conversions entre g/100 ml et mg/ml

Cprotéine en mg/ml = (A /e1 %) * 10

Exemple : si l’absorbance d’un échantillon de protéines mesurée à 280 nm par rapport à la référence est de 5,8 A, la concentration en protéines peut être calculée comme suit :

Cprotéine = (A / e1 %) * 10

Cprotéine = (5,8/6,6 g/100 ml) * 10

Cprotéine = 8,79 mg/ml

 

Les concentrations de protéines sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à 280 nm, du coefficient d’extinction sélectionné (ou saisi) et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base (ou correction d’analyse) à partir d’un seul point.

La concentration est rapportée en unités de masse. Vous trouverez sur Internet des calculateurs conçus pour convertir une concentration exprimée en masse en unités molaires en fonction de la séquence de l’échantillon.

 

 

Des valeurs d’absorbance à 260 nm et 280 nm sont utilisées pour calculer les rapports de pureté des échantillons de protéines mesurés.

Les rapports de pureté sont sensibles à la présence de contaminants dans l’échantillon, tels que les solvants et les réactifs résiduels typiquement utilisés lors de la purification de l’échantillon.

 

Valeurs mesurées

Absorbance A280

Remarque : les spectres d’absorbance des échantillons micro-volumes et des échantillons en cuvettes non classiques (autres que celles de 10 mm) sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.

 

Les valeurs d’absorbance d’acide nucléique sont mesurées à 280 nm en utilisant le spectre normalisé. Si la correction de ligne de base n’est pas sélectionnée, il s’agit de la valeur A280 rapportée et de la valeur utilisée pour calculer la concentration de protéines.

Si l’option Baseline Correction (correction de ligne de base) est sélectionnée, la valeur d’absorbance à 280 nm normalisée et corrigée pour la ligne de base est rapportée et utilisée pour calculer la concentration de protéines.

Absorbance A260

 

La valeur d’absorbance à 260 nm normalisée et corrigée pour la ligne de base (le cas échéant) à 260 nm sert à calculer les rapports A260/A280.

 

 

 

Longueur du trajet optique de l’échantillon

Pour les mesures de micro-volumes, le logiciel sélectionne la longueur de trajet optique optimale (entre 1,0 mm et 0,03 mm) en fonction de l’absorbance de l’échantillon à la longueur d’onde d’analyse.

Les mesures en cuvettes exploitent la longueur de trajet optique sélectionnée après l’activation du mode d’analyse en cuvettes. (voir Paramètres des cuvettes).

Les spectres et les valeurs d’absorbance affichés sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.

 

 

Valeurs rapportées

Concentration des protéines. Rapportée dans l’unité sélectionnée (mg/ml ou µg/ml). Les calculs sont effectués en appliquant l’équation de Beer-Lambert et se fondent sur la valeur d’absorbance corrigée des protéines.

Rapport de pureté A260/A280. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 280 nm. Il est généralement accepté qu’un rapport de pureté A260/A280 d’environ 0,57 indique un échantillon pur de protéines.

Remarque : si les rapports de pureté sont des indicateurs importants de la qualité des échantillons de protéines, la meilleure façon de vérifier leur qualité est d’évaluer leurs performances dans l’application subséquente d’intérêt (p. ex., analyse PCR en temps réel).

sample type (type d’échantillon) Détermine le coefficient d’expiration utilisées en complément de la loi de bière pour calculer la concentration de l’échantillon.

Correction de ligne de base. Longueur d’onde sélectionnée pour la correction de ligne de base et absorbance détectée à cette longueur d’onde.

Position. Indique si la mesure a été réalisée sur le socle ou en cuvette.

Longueur d’onde évaluée. Permet de saisir une longueur d’onde supplémentaire dont vous souhaitez inclure la valeur d’absorbance dans le rapport.

Coefficient d’extinction de masse (solution à 1 %).

Coefficient d’extinction molaire.

Poids moléculaire.

Contaminants Si un infectieux a été identifié par la Dans le logiciel Acclaro, le infectieux sera affiché dans cette colonne.

Corrigé. Affiche la concentration d’analyte corrigée , déterminée à l’aide du logiciel Acclaro, le cas échéant.

Agitateur. « Off » s’affiche lorsque l’option d’agitation  pour un modèle de cuvettes n’est pas utilisée. Lorsque l’agitateur est activé, la vitesse d’agitation est affichée.

 

 

 

Circuit thermique. « Off » ou « On » s’affiche pour indiquer si le porte-cuvette a été chauffé pendant la mesure.

Température mesurée. La température du porte-cuvette  pendant la mesure s’affiche.

Température cible. Affiche la température souhaitée du porte-cuvette.