Calculs

Les applications pour acides nucléiques s’appuient sur une version modifiée de l’équation de Beer-Lambert (illustrée ci-contre) pour calculer la concentration de l’échantillon selon un « facteur » qui correspond au coefficient d’extinction et à la longueur du trajet optique combinés.

 

Coefficients d’extinction et facteurs

Sur base des termes de l’équation de Beer-Lambert, le facteur (f) est défini comme suit :

facteur (f) = 1/(e * b)

Où :
e = coefficient d’extinction molaire à une longueur d’onde spécifique, exprimé en ng-cm/µl
b = longueur du trajet optique en cm

Par conséquent, la concentration de l’analyte (c) est calculée comme suit :

c = A * [1/(e * b)]

ou

c = A * f

Où :
c = concentration de l’analyte en ng/µl
A = absorbance en unités d’absorbance (A)
f = facteur en ng-cm/µl (voir ci-dessous)

Dans le cas des applications dsDNA Pro, ssDNA Pro et RNA Pro, les facteurs généralement acceptés pour les acides nucléiques sont utilisés en complément de la loi de Beer pour calculer la concentration des échantillons. L’application Custom Factor Pro (facteur personnalisé) utilise un facteur spécifié par l’utilisateur.

 

Facteurs utilisés

ADNdb (facteur = 50 ng-cm/µl)

ADNsb (facteur = 33 ng-cm/µl)

ARN (facteur = 40 ng-cm/µl)

Facteur personnalisé (facteur compris entre 15 ng-cm/µl et 150 ng-cm/µl saisi par l’utilisateur).

Les concentrations d’acides nucléiques sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à 260 nm, du facteur utilisé et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base (ou correction d’analyse) à partir d’un seul point.

La concentration est rapportée en unités de masse. Vous trouverez sur Internet des calculateurs conçus pour convertir une concentration exprimée en masse en unités molaires en fonction de la séquence de l’échantillon.

Des valeurs d’absorbance à 260 nm, 280 nm et parfois 230 nm sont utilisées pour calculer les rapports de pureté des échantillons d’acides nucléiques mesurés. Les rapports de pureté sont sensibles à la présence de contaminants dans l’échantillon, tels que les résidus de solvants et réactifs typiquement utilisés lors de la purification de l’échantillon.

 

 

Valeurs mesurées

Remarque : les spectres d’absorbance des échantillons micro-volumes sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.

 

Absorbance A260

Les valeurs d’absorbance des acides nucléiques sont mesurées à 260 nm en utilisant le spectre normalisé et un algorithme amélioré. Il s’agit de la valeur A260 rapportée si la correction de ligne de base n’est pas sélectionnée.

Si l’option Baseline Correction (correction de ligne de base) est sélectionnée, la valeur d’absorbance à la longueur d’onde de correction est soustraite à celle de l’absorbance à 260 nm. L’absorbance corrigée à 260 nm est rapportée et sert à calculer la concentration d’acides nucléiques.

Absorbance A230 et A280

les valeurs d’absorbance à 230 nm et 280 nm normalisées et corrigées pour la ligne de base (le cas échéant) sont utilisées pour calculer les rapports A260/A230 et A260/A280.

 

 

Valeurs rapportées

Concentration d’acides nucléiques. Rapportée dans l’unité sélectionnée (c.-à-d. ng/µl, µg/ul ou µg/ml). Les calculs sont effectués en appliquant la loi de Beer modifiée et se fondent sur la valeur d’absorbance des acides nucléiques corrigée.

 

Rapport de pureté A260/A280. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 280 nm. Il est généralement accepté qu’un rapport de pureté A260/A280 d’environ 1,8 indique un échantillon d’ADN pur (~2,0 pour l’ARN). Les solutions acidiques peuvent sous-représenter la valeur rapportée par 0,2-0,3 ; l’inverse est vrai pour les solutions basiques.

 

Rapport de pureté A260/A230. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 230 nm. Il est généralement accepté que des rapports de pureté A260/A230 situés entre 1,8 et 2,2 indiquent respectivement des échantillons d’ADN pur et d’ARN pur.

Remarque : si les rapports de pureté sont des indicateurs importants de la qualité des échantillons d’ADN ou d’ARN, la meilleure façon de vérifier leur qualité est d’évaluer leurs performances dans l’application subséquente d’intérêt
(p. ex., analyse PCR en temps réel).

Absorbance A260.

Absorbance A280.

R2 (260 nm). Coefficient de détermination de la droite de  meilleur ajustement pour les mesures à 260 nm.

Facteur. Utilisé en complément de la loi de Beer pour calculer la concentration de l’échantillon.

Correction de ligne de base. Longueur d’onde sélectionnée pour la correction de ligne de base et absorbance détectée à cette longueur d’onde.

Position. Indique que la mesure a été réalisée sur le socle.

Longueur d’onde évaluée. Permet de saisir une longueur d’onde supplémentaire dont vous souhaitez inclure la valeur d’absorbance dans le rapport.