Comme pour les autres applications pour protéines, l’application Proteins & Labels s’appuie sur l’équation de Beer-Lambert pour établir une corrélation entre absorbance et concentration d’après le coefficient d’extinction et la longueur du trajet optique de l’échantillon. Cette application propose six options (indiquées ci-contre) pour sélectionner un coefficient d’extinction approprié à chaque échantillon mesuré, qui sera intégré à l’équation de la loi de Beer afin de déduire la concentration de l’échantillon respectif. Si vous connaissez le coefficient d’extinction de l’échantillon, choisissez l’option e + MW (molaire) ou e1 % (masse) et saisissez sa valeur. Dans le cas contraire, calculez le coefficient d’extinction ou choisissez l’option qui correspond le mieux à la solution d’échantillon. Conseil : il est préférable que le coefficient d’extinction soit déterminé de manière empirique à l’aide d’une solution de la protéine à l’étude dont la concentration est connue et diluée dans le même tampon. |
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Options disponibles pour le coefficient d’extinction • 1 Abs = 1 mg/ml, où le type d’échantillon et/ou le coefficient d’extinction est inconnu (fournit une estimation approximative de la concentration en protéines) • BSA (albumine sérique bovine, 6,7 l/gm-cm) • IgG (tout anticorps de mammifère, 13,7 l/gm-cm) • Lysozyme (lysozyme de blanc d’oeuf, 26,4 l/gm-cm) • Autre protéine (e + MW), coefficient d’extinction molaire défini par l’utilisateur • Autre protéine (e1 %), coefficient d’extinction de masse défini par l’utilisateur
Remarque : consultez la rubrique Type d’échantillon pour plus d’informations. |
Les concentrations de protéines sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à 280 nm, du coefficient d’extinction sélectionné (ou saisi) et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base (ou correction d’analyse) à partir d’un seul point. La concentration est rapportée en unités de masse. Vous trouverez sur Internet des calculateurs conçus pour convertir une concentration exprimée en masse en unités molaires en fonction de la séquence de l’échantillon.
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Valeurs mesurées Remarque : La valeur d’absorbance à 850 nm est soustraite de toutes les longueurs d’onde du spectre. Par conséquent, l’absorbance à 850 nm est nulle dans les spectres affichés. Les spectres d’absorbance des échantillons micro-volumes et des échantillons en cuvettes non standard (non de 10 mm) sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.
• Les valeurs d’absorbance des protéines sont mesurées à 280 nm en utilisant le spectre normalisé et corrigé pour l’absorbance à 850 nm. Si la correction d’analyse et la correction pour le colorant ne sont pas sélectionnées, il s’agit de la valeur A280 rapportée et de la valeur utilisée pour calculer la concentration de protéines. • Si l’option Analysis Correction (correction d’analyse) est sélectionnée, la valeur d’absorbance à 280 nm normalisée et corrigée pour l’analyse est rapportée et utilisée pour calculer la concentration de protéines. • Si un colorant est utilisé, la méthode donne la valeur d’absorbance à 280 nm, normalisée et corrigée pour l’absorbance à 850 nm, pour l’analyse et pour l’effet du colorant, et se fonde sur ce résultat pour calculer la concentration de protéines. |
Les concentrations de colorant sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à la longueur d’onde d’analyse du colorant, du coefficient d’extinction du colorant et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Une correction de l’inclinaison de la ligne de base du colorant peut aussi être appliquée.
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• Les valeurs d’absorbance des colorants sont mesurées à des longueurs d’onde spécifiques. Consultez la rubrique Éditeur de colorants/chromophores pour connaître les longueurs d’onde utilisées. • Si vous appliquez une correction de l’inclinaison de la ligne de base du colorant, le logiciel trace une ligne de base linéaire entre 400 nm et 850 nm et soustrait la valeur d’absorbance de la ligne de base inclinée de chaque colorant à leur valeur d’absorbance à la longueur d’analyse. Les valeurs d’absorbance du colorant corrigées pour la ligne de base sont rapportées et servent à calculer les concentrations du colorant. Correction pour colorants • Les colorants prédéfinis ont des valeurs de correction connues pour l’absorbance à 260 et 280 nm. Consultez la rubrique Éditeur de colorants/chromophores pour connaître les valeurs de correction utilisées.
• La correction A280 pour colorant est soustraite à la valeur d’absorbance A280 utilisée pour calculer la concentration de protéines. |
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Longueur du trajet optique de l’échantillon • Pour les mesures de micro-volumes, le logiciel sélectionne la longueur de trajet optique optimale (entre 1,0 mm et 0,03 mm) en fonction de l’absorbance de l’échantillon à la longueur d’onde d’analyse. • Les mesures en cuvettes utilisent la longueur de trajet optique sélectionnée après l’activation du mode cuvette (voir Paramètres des cuvettes). • Les spectres et les valeurs d’absorbance affichés sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.
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• Position. Indique si la mesure a été réalisée sur le socle. • Longueur d’onde évaluée. Permet de saisir une longueur d’onde supplémentaire dont vous souhaitez inclure la valeur d’absorbance dans le rapport. • Concentration des protéines Rapportée dans l’unité sélectionnée (mg/ml ou µg/ml). Les calculs sont effectués en appliquant l’équation de Beer-Lambert et se fondent sur la valeur d’absorbance corrigée des protéines.
• Concentration du colorant 1/2. Rapportée en pmol/µl. Les calculs sont effectués en appliquant l’équation de la loi de Beer et se fondent sur la ou les valeurs d’absorbance corrigées pour (l’inclinaison de) la ligne de base. • Degré de marquage au colorant 1/2 . Précise le nombre moyen de molécules de fluorochrome par molécule de conjugué. • Agitateur. « Off » s’affiche lorsque l’option d’agitation pour un modèle de cuvettes n’est pas utilisée. Lorsque l’agitateur est activé, la vitesse d’agitation est affichée. • Circuit thermique. « Off » ou « On » s’affiche pour indiquer si le porte-cuvette a été chauffé pendant la mesure. • Température mesurée. La température du porte-cuvette pendant la mesure s’affiche. • Température cible. Affiche la température souhaitée du porte-cuvette. |