Cette méthode détermine la concentration de cultures de cellules microbiennes en solution en mesurant la diffusion de la lumière à 600 nm. |
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Principe de l’application OD600
L’application OD600 mesure la transmission de la lumière et utilise cette valeur pour calculer l’absorbance.En spectroscopie, la lumière transmise est définie comme toute lumière qui n’est pas absorbée, reflétée ou diffusée par un échantillon.
Dans le cas des cellules vivantes, la majeure partie de la lumière incidente est transmise à travers l’échantillon plutôt qu’être diffusée, reflétée ou absorbée. La quantité de lumière diffusée est faible et peut varier d’un instrument à l’autre.Par conséquent, les mesures de l’absorbance sont généralement très basses.
Les valeurs d’absorbance calculées sont utilisées pour déterminer la densité des cellules en solution en cellules/ml.Les concepts physiques et les formules qui permettent de faire corréler les propriétés optiques des cellules vivantes à leur concentration comprennent les suivants :
• Les cellules, qui ont un indice de réfraction différent de celui du milieu environnant, reflètent et diffusent la lumière de manière aléatoire hors du trajet de la lumière incidente.La quantité de lumière diffusée est proportionnelle à la densité des cellules dans l’échantillon.
• Le logiciel s’appuie sur l’équation de la loi de Beer pour établir le lien entre absorbance et concentration. Consultez la rubrique Calculs pour les mesures OD600 pour plus d’informations.
• Pour les analyses en cuvettes sur les instruments NanoDrop Ultra et NanoDrop Ultra FL, les valeurs d’absorbance sont généralement précises dans la plage entre 0,04 A et 1,5 A.Il est souvent nécessaire de procéder à des dilutions en série de l’échantillon pour amener les valeurs d’absorbance détectées dans cette plage.
• Toutes les mesures doivent être effectuées à l’aide du même type de spectrophotomètre et selon la même méthode (c.-à-d. soit sur socle soit en cuvette), car la quantité de lumière diffusée qui sera détectée varie en fonction de la configuration optique.Lorsque vous utilisez un spectrophotomètre ou une méthode différente, calculez et appliquez un facteur de conversion aux résultats rapportés.Par exemple, pour comparer des résultats OD obtenus soit sur socle soit en cuvette, vous pouvez calculer un facteur de conversion comme suit :
Facteur de conversion = OD cuvette/OD socle
Meilleures pratiques pour les mesures OD600
• Vérifiez que l’absorbance de l’échantillon se situe dans les limites de détection d’absorbance de l’instrument.
• Effectuez le blanc avec le milieu de croissance ou de culture utilisé pour mettre en suspension les cellules d’intérêt.
• Exécutez un cycle à blanc pour évaluer la contribution de votre solution de milieu à l’absorbance.Si le milieu de culture présente une forte absorbance à la longueur d’onde d’analyse (600 nm) ou à proximité de celle-ci, vous devrez envisager d’opter pour un autre milieu ou une autre application. Consultez la rubrique Choisir et mesurer un blanc pour obtenir des informations supplémentaires.
• Réalisez les dilutions nécessaires pour que les concentrations des échantillons de cultures ne dépassent pas la plage dynamique linéaire de l’analyse avant que les cultures n’atteignent leur phase stationnaire.Cette plage linéaire dépend en grande partie de la configuration optique et diffère donc entre les mesures sur socle et en cuvette.Pour déterminer la plage linéaire :
–Mesurez une série de dilutions à l’aide de la souche microbienne mise en culture pendant une nuit (environ 16 heures).
–Créez un diagramme des mesures d’OD600 en fonction du facteur de dilution
La limite supérieure de détection est la valeur d’OD600 à laquelle la corrélation linéaire entre les facteurs de dilution et les valeurs d’OD600 disparaisse.
• Mélangez chaque échantillon délicatement mais minutieusement juste avant d’en prélever une aliquote à mesurer.
• Pour les mesures de micro-volumes :
–Assurez-vous que la surface des socles a été correctement nettoyée et conditionnée.
–Évitez d’introduire des bulles d’air lors des étapes de mélange et de pipetage.
–Démarrez la mesure dès que possible pour éviter toute sédimentation ou évaporation.
–Respectez les bonnes pratiques pour les mesures de micro-volumes.
–Utilisez un volume d’échantillon de 2 µl. Consultez la rubrique Volumes d’échantillon recommandés pour obtenir des informations supplémentaires.
–Pour les échantillons dilués qui présentent une faible absorbance à 600 nm, utilisez une autre longueur d’onde d’analyse, telle que 400 nm, ou effectuez la mesure en cuvettes et non en micro-volumes.
• Pour les mesures en cuvettes (instruments NanoDrop Ultra et NanoDrop UltraC FL uniquement) :
–Utilisez des cuvettes propres en plastique, en verre ou en quartz.
–Respectez les meilleures pratiques pour les mesures en cuvettes.
–N’utilisez pas la fonction stirring (agitation) pour cette analyse.