L’application Protein A280 Pro s’appuie sur l’équation de Beer-Lambert pour corréler l’absorbance avec la concentration. Résoudre la loi de Beer pour la concentration donne lieu à l’équation ci-contre.
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Équation de Beer-Lambert (résolue pour la concentration) c = A / (e * b) où : A = absorbance UV en unités d’absorbance (AU) e = absorptivité (ou coefficient d’extinction) molaire dépendant de la longueur d’onde en litres/mol-cm b = longueur du trajet optique en cm c = concentration de l’analyte en moles/litre ou molarité (M) Remarque : diviser l’absorbance mesurée d’une solution d’échantillon par son coefficient d’extinction molaire donne la concentration molaire de l’échantillon. Consultez la rubrique Coefficients d’extinction publiés pour plus d’informations sur la différence entre valeurs de concentration molaire et massique.
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Le coefficient d’extinction d’un peptide ou d’une protéine est lié à sa composition en acides aminés tryptophane (W), tyrosine (Y) et cystéine (C). Conseil : le coefficient d’extinction est spécifique à la longueur d’onde pour chaque protéine et peut être influencé par le type de tampon, la force ionique et le pH de l’échantillon. |
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Coefficients d’extinction pour les protéines À 280 nm, le coefficient d’extinction est estimé de façon approximative par la somme pondérée des coefficients d’extinction molaire à 280 nm de ces trois acides aminés, comme illustré par l’équation ci-dessous : e = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125) Où : |
Cette application propose six options (indiquées ci-contre) pour sélectionner un coefficient d’extinction approprié à chaque échantillon mesuré, qui sera intégré à l’équation de la loi de Beer afin de déduire la concentration de l’échantillon respectif. Si vous connaissez le coefficient d’extinction de l’échantillon, choisissez l’option e + MW (molaire) ou e1 % (masse) et saisissez sa valeur. Dans le cas contraire, calculez le coefficient d’extinction ou choisissez l’option qui correspond le mieux à la solution d’échantillon. Conseil : il est préférable que le coefficient d’extinction soit déterminé de manière empirique à l’aide d’une solution de la protéine à l’étude dont la concentration est connue et diluée dans le même tampon.
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Options disponibles pour le coefficient d’extinction • 1 Abs = 1 mg/ml, où le type d’échantillon et/ou le coefficient d’extinction est inconnu (fournit une estimation approximative de la concentration en protéines) • BSA (albumine sérique bovine, 6,7 l/gm-cm) • IgG (tout anticorps de mammifère, 13,7 l/gm-cm) • Lysozyme (lysozyme de blanc d’oeuf, 26,4 l/gm-cm) • Autre protéine (e + MW), coefficient d’extinction molaire défini par l’utilisateur • Autre protéine (e1 %), coefficient d’extinction de masse défini par l’utilisateur Remarque : consultez la rubrique Type d’échantillon pour plus d’informations. |
Les concentrations de protéines sont calculées en fonction de la valeur d’absorbance à 280 nm, du coefficient d’extinction sélectionné (ou saisi) et de la longueur du trajet optique de l’échantillon. Il est aussi possible d’appliquer une correction de ligne de base (ou correction d’analyse) à partir d’un seul point. La concentration est rapportée en unités de masse. Vous trouverez sur Internet des calculateurs conçus pour convertir une concentration exprimée en masse en unités molaires en fonction de la séquence de l’échantillon.
Des valeurs d’absorbance à 260 nm et 280 nm sont utilisées pour calculer les rapports de pureté des échantillons de protéines mesurés. Les rapports de pureté sont sensibles à la présence de contaminants dans l’échantillon, tels que les solvants et les réactifs résiduels typiquement utilisés lors de la purification de l’échantillon. |
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Remarque : les spectres d’absorbance des échantillons micro-volumes sont normalisés sur l’équivalent d’un trajet optique de 10 mm.
• Les valeurs d’absorbance d’acide nucléique sont mesurées à 280 nm en utilisant le spectre normalisé. Si la correction de ligne de base n’est pas sélectionnée, il s’agit de la valeur A280 rapportée et de la valeur utilisée pour calculer la concentration de protéines. • Si l’option Baseline Correction (correction de ligne de base) est sélectionnée, la valeur d’absorbance à 280 nm normalisée et corrigée pour la ligne de base est rapportée et utilisée pour calculer la concentration de protéines. Absorbance A260
• La valeur d’absorbance à 260 nm normalisée et corrigée pour la ligne de base (le cas échéant) à 260 nm sert à calculer les rapports A260/A280.
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• Concentration des protéines. Rapportée dans l’unité sélectionnée (mg/ml ou µg/ml). Les calculs sont effectués en appliquant l’équation de Beer-Lambert et se fondent sur la valeur d’absorbance corrigée des protéines. • Rapport de pureté A260/A280. Rapport entre l’absorbance corrigée à 260 nm et l’absorbance corrigée à 280 nm. Il est généralement accepté qu’un rapport de pureté A260/A280 d’environ 0,57 indique un échantillon pur de protéines. Remarque : si les rapports de pureté sont des indicateurs importants de la qualité des échantillons de protéines, la meilleure façon de vérifier leur qualité est d’évaluer leurs performances dans l’application subséquente d’intérêt • Type d’échantillon. Détermine le coefficient d’extinction à utiliser en complément de la loi de Beer pour calculer la concentration de l’échantillon. • R2 (280 nm). Coefficient de détermination de la droite de meilleur ajustement pour les mesures à 280 mm. • Correction de ligne de base. Longueur d’onde sélectionnée pour la correction de ligne de base et absorbance détectée à cette longueur d’onde. • Position. Indique que la mesure a été réalisée sur le socle. • Longueur d’onde évaluée. Permet de saisir une longueur d’onde supplémentaire dont vous souhaitez inclure la valeur d’absorbance dans le rapport. • Coefficient d’extinction de masse (solution à 1 %). • Coefficient d’extinction molaire.
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