Mikrovolumenmessungen – Vorgehensweise

 

Oberflächenspannung

Extinktionsspektrum

Probenextinktion

Probenkonzentration

Basislinienkorrektur

Fluoreszierende Proben

Konzentration fluoreszierender Proben

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112505_NanoDrop_One_Sample_Retention_System.jpg

 

Oberflächenspannung

Die NanoDrop Ultra -Spektrophotometer und Fluorometer nutzen die Oberflächenspannung, um eine kleine Probenmenge zwischen zwei Messplätzen zu halten. Das patentierte Probenhaltesystem ermöglicht das Messen von hochkonzentrierten Proben, ohne dass Verdünnungen notwendig werden.

Ein in den oberen Messplatz eingearbeitetes Glasfaserkabel führt zu einer Xenon-Lichtquelle. Ein zweites, im unteren Messplatz eingearbeitetes Glasfaserkabel führt zu einem Detektor. Wenn der Gerätearm abgesenkt ist, bildet die Probe eine Flüssigkeitssäule, die die Lücke zwischen den beiden Glasfaserkabeln überbrückt.

112559_Nucleic_Acid_Spectrum_Drawing.png

 

Extinktionsspektrum

Das Licht passiert durch die Flüssigkeitssäule zum Detektor, der ein Spektrum aus Extinktion in Abhängigkeit von der Wellenlänge erzeugt. Das Spektrum zeigt die Lichtmenge, die von den Molekülen der Probe bei jeder gemessenen Wellenlänge absorbiert wird.

Hinweis: Um eine Verdampfung zu verhindern, die die Messgenauigkeit beeinflusst, senken Sie den Gerätearm sofort nach dem Aufbringen einer Probe oder Leerprobe.

Das Beispiel links zeigt ein typisches Extinktionsspektrum einer Nukleinsäureprobe. Das Spektrum wurde in einem Wellenlängenbereich von 190 nm bis 850 nm gemessen. Der angezeigte Bereich kann für jede Anwendung variieren.

 

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Probenextinktion

Bei der Bestimmung des Geräteleerwerts wird ein Referenzspektrum einer Leerprobenlösung aufgenommen und gespeichert. Für jede Probenmessung werden die Probenintensitäten zusammen mit den Leerprobenintensitäten verwendet, um die Gesamtextinktion der Probe gemäß der Gleichung auf der linken Seite zu berechnen.

Beer-Lambert-Gleichung

LearnCtr00215.jpg

 

Wobei:

A = Extinktion in Extinktionseinheiten (E)

e = wellenlängenabhängiger molarer Absorptionskoeffizient (oder Extinktionskoeffizient) in l/mol-cm

b = Schichtdickein cm

c = Analytkonzentration in mol/l oder Molarität (M)

Probenkonzentration

Die auf der linken Seite gezeigte Beer-Lambert-Gleichung (Beer’sches Gesetz) wird verwendet, um die Probenextinktion mit der Konzentration zu korrelieren.

Die Schichtdicke ist der Abstand zwischen den beiden Messplätzen, die während jeder Messung in Echtzeit variiert. Diese automatische Schichtdicketechnik erzeugt genaue Konzentrationsergebnisse über einen breiten Dynamikbereich.

 

Basislinienkorrektur

Bei einigen Anwendungen kann das Gerät so konfiguriert werden, dass es eine Basislinienkorrektur an jeder Messung anwendet, um den Offset zu minimieren, der durch die Lichtstreuung aufgrund von Partikeln in den Probenspektren verursacht wird. Die Korrektur subtrahiert den Extinktionswert bei einer Referenzwellenlänge, die nahe Null von Extinktionswert bei jeder Wellenlänge über das gesamte Spektrum liegt, und im Wesentlichen das Spektrum an Null-Extinktionseinheiten bei der Referenzwellenlänge „verankert“.

 

Relative Fluoreszenz der Probe

Die rote oder blaue LED wird als Lichtquelle verwendet. Das Licht durchläuft einen Anregungsfilter, die Flüssigkeitssäule und einen Emissionsfilter und gelangt dann zum Detektor, der die relative Fluoreszenz der Probe aufzeichnet.

 

Konzentration fluoreszierender Proben

Bei der Berechnung der Konzentrationen wird ein Algorithmus zur Kurvenanpassung verwendet, der mindestens zwei Standards erfordert. Die NanoDrop Ultra dsDNA BR-, dsDNA HS- und RNA HS-Fluoreszenz-Assays verwenden alle einen modifizierten Hill-Plot.