Der Protein-Bradford-Assay verwendet den Farbstoff Coomassie-Brillantblau als kolorimetrisches Nachweisreagenz zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration in ungereinigten Proteinproben. Diese Anwendung ist nützlich für die Messung verdünnter Proteinlösungen, die eine geringere Nachweisempfindlichkeit erfordern, oder Proteine bei Vorhandensein von Komponenten, die eine signifikante Extinktion zwischen 200 nm und 280 nm aufweisen, was direkte Proteinmessungen bei 280 nm oder 205 nm ausschließt. Diese Anwendung misst die Extinktion bei 595 nm und verwendet eine Standardkurve, um die Proteinkonzentration zu berechnen. Weitere Informationen finden Sie unter Arbeiten mit Standardkurven. Eine Einzelpunkt-Basislinienkorrektur wird vorgenommen.
Vor Beginn...
Bevor Sie die Messungen mit dem NanoDrop Ultra-Gerät durchführen, stellen Sie den Gerätearm auf und reinigen Sie die oberen und unteren Messplätze. Sie sollten die Messplätze wenigstens mit einem frischen Labortuch abwischen. Weitere Informationen finden Sie unter Reinigung der Messplätze.
NOTICE • Verwenden Sie keine Spritzen oder Sprühflasche auf oder in der Nähe des Geräts, da Flüssigkeiten in das Gerät fließen und dauerhafte Schäden verursachen können. • Verwenden Sie an den Messplätzen keine Fluorwasserstoffsäure (HF). Fluoridionen schädigen die Quarzglasfaserkabel dauerhaft. |
Verfahren
1. Wählen Sie auf dem Startbildschirm die Registerkarte Proteins (Proteine)und dann Protein Bradford.
2. Konfigurieren Sie bei Bedarf beliebige der Einstellungsoptionen und wählen Sie Save (Speichern). (Geben Sie für jeden Standard einen Kurven-Typ und die Anzahl der Wiederholungen an und geben Sie die Konzentration jedes Standards ein.)
Tipp: Für diesen Assay stellen Sie Curve Type (Kurventyp) auf „2nd Order Polynomial“ (Polynom 2. Grades) und Replicates (Replikate) auf 3.
3. Wenn Sie ein NanoDrop Ultrac- oder NanoDrop Ultrac FL-Modell verwenden, wählen Sie den richtigen Messpfad aus.
–Wenn Sie eine Küvette verwenden, wählen Sie im Dropdown-Menü oben auf dem Bildschirm Cuvette (Küvette) aus, um die Küvetteneinstellungen anzuzeigen. Wählen Sie die gewünschte Schichtdicke, Rührgeschwindigkeit und Heizleistung aus und schließen Sie dann das Dropdown-Menü.
–Wenn Sie den Messplatz für Messungen verwenden, lassen Sie Pedestal (Messplatz) als ausgewählte Einstellung oben auf dem Bildschirm.
4. Leerwertmessung:
–Pipettieren Sie 2 µl DI H2O auf den unteren Messplatz und senken Sie den Arm, oder setzen Sie eine Leerwertküvette mit DI H2O in den Küvettenhalter ein.
Tipp: Wenn Sie eine Küvette verwenden, achten Sie darauf, den Lichtweg der Küvette mit dem Lichtweg des Geräts abzugleichen.
–Tippen Sie auf Blank (Leerprobe) und warten Sie, bis die Messung beendet ist.
Tipp: Wenn Auto-Measure (Auto-Messung) aktiviert (On) ist, startet die Standardmessung automatisch, nachdem Sie den Gerätearm gesenkt haben. (Diese Option ist für Küvettenmessungen nicht verfügbar.)
–Stellen Sie den Gerätearm auf und reinigen Sie beide Messplätze mit einem frischen Labortuch oder entfernen Sie die Küvette.
5. Messen des Referenzstandards:
–Pipettieren Sie 2 μl Referenzlösung auf den Messplatz oder setzen Sie die Referenzküvette ein (die Referenzlösung sollte keine der Standard Proteine enthalten; weitere Informationen finden Sie unter Arbeiten mit Standardkurven).
–Wählen Sie Measure (Messen) aus und warten Sie, bis die Messung abgeschlossen ist.
–Stellen Sie den Gerätearm auf und reinigen Sie beide Messplätze mit einem frischen Wischtuch oder entfernen Sie die Küvette.
–Wenn die Einstellung für Wiederholungen größer als 1 ist, wiederholen Sie die Messung.
6. Messung der verbleibenden Standards:
–Pipettieren Sie 2 µl von Standard 1 auf den Messplatz oder setzen Sie die Standard 1-Küvette ein.
–Wählen Sie Measure (Messen) aus und warten Sie, bis die Messung abgeschlossen ist.
–Stellen Sie den Gerätearm auf und reinigen Sie beide Messplätze mit einem frischen Wischtuch oder entfernen Sie die Küvette.
–Wenn die Wiederholungseinstellung größer als 1 ist, wiederholen Sie die Messung.
–Wiederholen Sie die obigen Teilschritte für jeden weiteren Standard (wenn die angegebene Anzahl von Standards und Wiederholungen gemessen wurde, werden Sie gefragt, ob Sie die Standards erneut messen, weitere Standards laden oder mit der Messung von Proben beginnen möchten).
–Wenn Sie die Messung der Standards beendet haben, wählen Sie Measure Samples (Proben messen) (nach links wischen, um die Standardkurve zu sehen), wenn Sie die lokale Steuerungssoftware verwenden, oder wählen Sie die Registerkarte Curve (Kurve), wenn Sie die PC-Steuerungssoftware verwenden.
7. Proben messen:
–Pipettieren Sie 2 µl der Probe 1 auf den Messplatz oder setzen Sie die Probe 1-Küvette ein.
–Wählen Sie Measure Samples (Proben messen) aus und warten Sie, bis die Messung abgeschlossen ist.
–Stellen Sie den Gerätearm auf und reinigen Sie beide Messplätze mit einem frischen Wischtuch oder entfernen Sie die Küvette.
–Wenn die Einstellung für Wiederholungen größer als 1 ist, wiederholen Sie die Messung.
8. Wenn Sie mit dem Messen der Proben fertig sind, wählen Sie End Experiment (Versuch beenden).
9. Stellen Sie den Gerätearm auf und reinigen Sie beide Messplätze mit einem frischen Wischtuch oder entfernen Sie die Probenküvette.
• Bewährte Methoden für Proteinmessungen
• Messen einer Mikrovolumenprobe
• Messen einer Probe mit einer Küvette
• Vorbereiten von Proben und Leerwerten
• Grundlegende Gerätefunktionen