Die Acclaro Pro Nukleinsäureanwendungen verwenden eine Modifikation der Beer-Lambert-Gleichung (siehe rechts), um die Probenkonzentration zu berechnen, bei welcher der Extinktionskoeffizient und die Schichtdicke kombiniert und als „Faktor“ bezeichnet werden. |
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Extinktionskoeffizienten vs. Faktoren Der Faktor (f) wird in der Beer-Lambert-Gleichung wie folgt definiert: Faktor (f) = 1/(e * b) wobei: Als Ergebnis wird die Analytkonzentration (c) wie folgt berechnet: c = A * [1/(e * b)] oder c = A * f wobei: |
Für die dsDNA Pro-, ssDNA Pro- und RNA Pro-Anwendungen werden die allgemein anerkannten Faktoren für Nukleinsäuren in Verbindung mit dem Beer'schen Gesetz verwendet, um die Probenkonzentration zu berechnen. Für die Anwendung „Custom Factor Pro (Benutzerspezifischer Faktor Pro)“ wird der vom Benutzer angegebene Faktor verwendet. |
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• dsDNA (Faktor = 50 ng-cm/µl) • ssDNA (Faktor = 33 ng-cm/µl) • RNA (Faktor = 40 ng-cm/µl) • Benutzerdefinierter Faktor (vom Benutzer eingegebener Faktor zwischen 15 ng-cm/µl und 150 ng-cm/µl |
Die berechneten Nukleinsäurekonzentrationen basieren auf dem Extinktionswert bei 260 nm, dem verwendeten Faktor und der Schichtdicke der Probe. Eine Einzelpunkt-Basislinienkorrektur (oder -Analysenkorrektur) kann ebenfalls angewendet werden. Die Konzentration wird in Masseneinheiten angegeben. Im Internet stehen Rechner zur Verfügung, mit denen Sie die Konzentration von Masse- in Mol-Einheiten umrechnen können, basierend auf der Probensequenz. Extinktionswerte bei 260 nm, 280 nm und manchmal 230 nm werden zur Berechnung der Reinheitsverhältnisse für die gemessenen Nukleinsäureproben verwendet. Verunreinigungen in der Probe, wie z. B. Lösungsmittelrückstände und Reagenzien, die typischerweise bei der Probenreinigung verwendet werden, wirken sich auf die Reinheitsverhältnisse aus.
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Messwert Hinweis: Mikrovolumen-Extinktionsmessungen werden auf eine äquivalente Weglänge von 10 mm normiert.
• Die Extinktionswerte von Nukleinsäuren werden bei 260 nm unter Verwendung des normalisierten Spektrums mit einem verbesserten Algorithmus gemessen. Dies ist der gemessene E260-Wert, wenn Basislinienkorrektur nicht ausgewählt ist. • Wenn die Basislinienkorrektur ausgewählt ist, wird der Extinktionswert bei der Korrekturwellenlänge von der Extinktion bei 260 nm subtrahiert. Die korrigierte Extinktion bei 260 nm wird angezeigt und zur Berechnung der Nukleinsäurekonzentration verwendet. E230 und E280 Extinktion • Normalisierte und Basislinien-korrigierte (falls ausgewählt) Extinktionswerte bei 230 nm und 280 nm werden zur Berechnung der Verhältnisse E260/E230 und E260/E280 verwendet. |
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• Nukleinsäurenkonzentration. Angabe in ausgewählten Einheiten (d. h. ng/µl, µg/µl oder µg/ml). Die Berechnungen basieren auf der modifizierten Gleichung des Beer'schen Gesetzes unter Verwendung des korrigierten Extinktionswerts der Nukleinsäuren.
• E260/E280 Reinheitsverhältnis. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 280 nm. Ein E260/E280-Reinheitsverhältnis von ca. 1,8 wird für DNA im Allgemeinen als „rein“ angesehen (ca. 2,0 für RNA). Saure Lösungen können den angegebenen Wert um 0,2–0,3 zu niedrig darstellen; das Gegenteil gilt für basische Lösungen.
• Reinheitsverhältnis E260/E230. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 230 nm. Ein E260/E230-Reinheitsverhältnis zwischen 1,8 und 2,2 gilt im Allgemeinen als „rein“ für DNA und RNA. Hinweis: Obwohl Reinheitsverhältnisse wichtige Indikatoren für die Probenqualität sind, ist der beste Indikator für die Qualität die Funktionalität in der nachgelagerten gewünschten Anwendung (z. B. Echtzeit-PCR). • E260 Extinktion. • E280 Extinktion. • R2 (260 nm). Bestimmtheitsmaß für die beste Ausgleichsgerade für 260-nm-Messungen. • Faktor. Wird in Verbindung mit dem Beer'schen Gesetz zur Berechnung der Probenkonzentration verwendet. • Basislinienkorrektur. Die für die Basislinienkorrektur ausgewählte Wellenlänge und die bei dieser Wellenlänge gemessene Extinktion. • Messort. Zeigt an, dass die Messung auf dem Messplatz durchgeführt wurde. • Gemessene Wellenlängen. Geben Sie eine weitere Wellenlänge ein, deren Extinktionswert in den Bericht aufgenommen werden soll.
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