Wie bei den anderen Proteinanwendungen wird auch bei Proteine & Marker die Beer-Lambert-Gleichung verwendet, um die Extinktion mit der Konzentration auf der Grundlage des Extinktionskoeffizienten und der Schichtdicke der Probe zu korrelieren. Diese Anwendung bietet sechs Optionen (siehe rechts) zur Auswahl eines geeigneten Extinktionskoeffizienten für jede gemessene Probe, der in Verbindung mit dem Beersch'en Gesetz zur Berechnung der Probenkonzentration verwendet werden kann. Wenn der Extinktionskoeffizient der Probe bekannt ist, wählen Sie die Option e + MW (molar) oder e1% (Masse) aus und geben Sie den Wert ein. Andernfalls berechnen Sie den Extinktionskoeffizienten oder wählen Sie die Option, die der Probenlösung am besten entspricht. Tipp: Idealerweise sollte der Extinktionskoeffizient empirisch unter Verwendung einer Lösung des Forschungsproteins in bekannter Konzentration im gleichen Puffer bestimmt werden. |
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Verfügbare Optionen für den Extinktionskoeffizienten • 1 Ext. = 1 mg/ml, wobei Probentyp und/oder Extinktionskoeffizient unbekannt sind (ergibt eine grobe Schätzung der Proteinkonzentration) • BSA (Rinderserumalbumin, 6,7 l/gm-cm) • IgG (beliebiger Säugetierantikörper, 13,7 l/gm-cm) • Lysozym (Eiweißlysozym, 26,4 l/gm-cm) • Anderes Protein ( e + MW), benutzerspezifischer molarer Extinktionskoeffizient • Anderes Protein ( e 1%), benutzerspezifischer Massenextinktionskoeffizient
Hinweis: Weitere Informationen finden Sie unter Probentyp. |
Die berechneten Proteinkonzentrationen basieren auf dem Extinktionswert bei 280 nm, dem ausgewählten (oder eingegebenen) Extinktionskoeffizienten und der Schichtdicke der Probe. Es kann eine Einzelpunkt-Basislinienkorrektur (oder Analysekorrektur) angewendet werden. Die Konzentration wird in Masseeinheiten angegeben. Zur Umrechnung der Konzentration von Masse in Mol-Einheiten auf der Grundlage der Probensequenz stehen im Internet Rechner zur Verfügung.
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Messwerte Hinweis: Der Extinktionswert bei 850 nm wird von allen Wellenlängen im Probenspektrum subtrahiert. Daher ist die Absorption bei 850 nm in den angezeigten Spektren gleich Null. Bei Mikrovolumen-Extinktionsmessungen und Messungen mit nicht standardisierten Küvetten (andere Küvetten als 10 mm-Küvetten) werden die Spektren auf eine 10-mm-äquivalente Schichtdicke normiert.
• Die Extinktionswerte von Proteinen werden bei 280 nm unter Verwendung des bei 850 nm korrigierten und normalisierten Spektrums gemessen. Wenn Analysekorrektur und Farbstoffkorrektur nicht ausgewählt sind, ist dies der ermittelte E280-Wert und der Wert, der zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet wird. • Wenn eine Analysenkorrektur ausgewählt wurde, werden der 850-korrigierte, normalisierte und analysenkorrigierte Extinktionswert bei 280 nm ausgewiesen und zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet. • Wenn ein Farbstoff verwendet wurde, wird der 850-korrigierte, normalisierte, analysenkorrigierte und farbstoffkorrigiere Extinktionswert bei 280 nm ausgewiesen und zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet. |
Die Farbstoffkonzentrationen werden aus dem Extinktionswert der Wellenlänge des Farbstoffs bei der Analyse, dem Extinktionskoeffizienten des Farbstoffs und der Schichtdicke der Probe berechnet. Eine Basislinienkorrektur für den Farbstoff kann ebenfalls angewendet werden.
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• Farbstoff-Extinktionswerte werden bei bestimmten Wellenlängen gemessen. Siehe Farbstoff/Chromophor-Editor für die verwendeten Analysewellenlängen. • Wenn die Basislinienkorrektur Farbstoff ausgewählt ist, wird eine lineare Basislinie zwischen 400 nm und 850 nm gezogen und für jeden Farbstoff wird der Extinktionswert der geneigten Basislinie vom Extinktionswert bei der Analysewellenlänge jedes Farbstoffs subtrahiert. Die mit Basislinienkorrektur bereinigten Extinktionswerte werden aufgezeichnet und zur Berechnung der Farbstoffkonzentrationen verwendet. Farbstoffkorrektur • Vordefinierte Farbstoffe haben bekannte Korrekturwerte für E260 und E280. Siehe Farbstoff/Chromophor-Editor für die verwendeten Korrekturwerte.
• Die E280-Farbstoffkorrektur wird vom E280-Extinktionswert abgezogen, der zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet wird. |
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• Die Software wählt für Messungen von Mikrovolumen die optimale Schichtdicke, (zwischen 1,0 mm und 0,03 mm) basierend auf der Extinktion der Probe bei der Analysewellenlänge aus. • Bei Küvettenmessungen wird die nach dem Umschalten in den Küvettenmodus ausgewählte Schichtdicke verwendet (siehe Küvetteneinstellungen). • Die dargestellten Spektren und Extinktionswerte sind auf eine äquivalente Schichtdicke von 10 mm normiert.
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• Messort. Zeigt an, ob die Messung am Messplatz durchgeführt wurde. • Gemessene Wellenlänge. Geben Sie eine zusätzliche Wellenlänge ein, deren Extinktionswert ins Protokoll aufgenommen werden soll. • Proteinkonzentration. Wird in der ausgewählten Einheit angegeben (mg/ml oder μg/ml). Die Berechnungen basieren auf der Beer-Lambert-Gleichung unter Verwendung des korrigierten Protein-Extinktionswerts.
• Farbstoff1/Farbstoff2-Konzentration . Angabe in pmol/µl. Die Berechnungen basieren auf dem Beer’schen Gesetz unter Verwendung von (abfallenden) basislinienkorrigierten Farbstoffextinktionswert(en). • Farbstoff1/Farbstoff 2-Markierungsgrad . Gibt die durchschnittliche Anzahl der Fluorophor-Moleküle pro Molekül Konjugat an. • Rührer. „Off/Aus“ wird angezeigt, wenn die Rührfunktion bei einem Küvettenmodell nicht verwendet wird. Wenn die Rührfunktion verwendet wird, wird die Rührgeschwindigkeit angezeigt. • Heizelement. Es wird „Off/Aus“ oder „On/Ein“ angezeigt, um zu zeigen, ob die Küvetten während der Messung beheizt wurde. • Gemessene Temperatur. Die Temperatur der Küvette während der Messung wird angezeigt. • Zieltemperatur. Die gewünschte Temperatur der Küvette wird angezeigt. |