Protein Bradford

Misst die Gesamtproteinkonzentration von ungereinigten Proteinproben mit einem kolorimetrischen Nachweisreagenz mit Coomassie-Brillantblau als Farbstoff.

Messung von Protein Bradford

Messergebnisse

Einstellungen

Nachweisgrenzen

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Die Theorie hinter dem Protein-Bradford-Assays

Der Protein-Bradford-Assay nutzt die proteininduzierte Extinktionsänderung des Farbstoffs Coomassie-Brillantblau zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration. Der an Protein bindende Farbstoff-Komplex wird bei 595 nm gemessen und die Basislinienkorrektur erfolgt mit dem Extinktionswert bei 750 nm. Vorformulierte Kits mit einem stabilisierten Reagenzien-Gemisch aus Coomassie-Brillanblau-Farbstoff, Alkohol und Tensid sind bei uns oder einem Händler vor Ort erhältlich.

So maximieren Sie die Zuverlässigkeit des Protein-Bradford-Assays:

Arbeiten Sie zügig und lassen Sie vorbereitete Standards oder Proben nicht länger als notwendig liegen. Coomassie-Farbstoff-Farbstoff- und Coomassie-Farbstoff-Protein-Aggregate können mit zunehmender Entwicklungszeit Partikel bilden, was zu erheblichen Schwankungen in den Extinktionswerten führt.

Messen Sie die Standards und Proben dreimal und verwenden Sie für jede Messung ein neues Aliquot. Bei Messplatz-Messungen ist das Gesamtsignal des Analyten (Protein-Farbstoff) bei 595 nm aufgrund der Schichtdicke des Messplatzes von 1,0 mm, der Coomassie-Farbstoffkonzentration und des sauren pH-Werts auf ca. 0–0,150 A begrenzt.

Note  Wenn Sie ein NanoDrop UltraC oder ein BioDrop UltraCFL-Gerät nutzen, führt die Verwendung der Küvettenoption zu einem höheren Extinktionssignal.

Protein-Assaykits und Protokolle

Aktuelle Kits und Protokolle für die NanoDrop Ultra-Geräte finden Sie auf der NanoDrop-Website. Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers des Assaykits für alle Standards und Proben (unbekannt). Stellen Sie sicher, dass alle während des Assays dem gleichen Zeitplan entsprechen und der gleichen Temperatur ausgesetzt sind.

Proteinstandards zum Erzeugen einer Standardkurve können ebenfalls vom Hersteller des Kits bezogen werden. Da die NanoDrop Ultra-Messplätze höhere Proteinkonzentrationen als herkömmliche Küvetten-basierte Spektralphotometer messen können, benötigen Sie eventuell eigene Proteinstandards bei höheren Konzentrationen als den vom Hersteller zur Verfügung gestellten. Beispielsweise können zusätzliche Standards erforderlich werden, um sicherzustellen, dass die Standardkurve den dynamischen Bereich des Assays und den erwarteten Bereich der unbekannten Proben abdeckt.

Protein-Bradford-Standardkurven

Für die kolorimetrische Proteinanalyse ist eine Standardkurve erforderlich.

Jeder Versuch erfordert eine Standardkurve. Sie können eine neue Standardkurve erstellen, indem Sie die Option Setup standards
(Standards Einstellungen)
 auswählen, oder einen Standard aus einem zuvor durchgeführten Versuch importieren, indem Sie auf dem Einstellungen-Bildschirm der Anwendung die Option Load standards (Standards laden) auswählen.

Weitere Informationen finden Sie unter Arbeiten mit Standardkurven.