Misst die Gesamtproteinkonzentration von ungereinigten Proteinproben mit einem kolorimetrischen Bicinchoninsäure-Nachweisreagenz. |
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Die Theorie hinter dem Protein BCA-Assays
Der Protein BCA-Assay verwendet Bicinchoninsäure (BCA) als Nachweisreagenz für Cu+1,, das gebildet wird, wenn Cu+2, durch bestimmte Proteine in einer alkalischen Umgebung reduziert wird. Ein violettes Reaktionsprodukt entsteht durch die Chelatbildung von zwei Molekülen BCA mit einem Kupferion (Cu+1,). Das Cu-BCA-Chelat, das in Anwesenheit von Protein gebildet wird, wird bei 562 nm gemessen und wird unter Verwendung Extinktionswerts bei 750 nm Basislinien-korrigiert. Vorformulierte Kits mit BCA-Reagenz und CuSO4 sind bei uns oder einem Händler vor Ort erhältlich.
Protein-Assay-Kits und Protokolle
Aktuelle Kits und Protokolle für die NanoDrop Ultra-Geräte finden Sie auf der NanoDrop-Website. Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers des Assaykits für alle Standards und Proben (unbekannt). Stellen Sie sicher, dass alle während des Assays dem gleichen Zeitplan entsprechen und der gleichen Temperatur ausgesetzt sind.
Proteinstandards zur Generierung einer Standardkurve können auch vom Kit-Anbieter bereitgestellt werden. Da die NanoDrop Ultra-Messplätze höhere Proteinkonzentrationen als herkömmliche Küvetten-basierte Spektralphotometer messen können, benötigen Sie eventuell eigene Proteinstandards bei höheren Konzentrationen als den vom Hersteller zur Verfügung gestellten. Beispielsweise können zusätzliche Standards erforderlich sein, um sicherzustellen, dass die Standardkurve den dynamischen Bereich des Assays und den erwarteten Bereich der unbekannten Proben abdeckt.
Für die kolorimetrische Proteinanalyse ist eine Standardkurve erforderlich.
• Für jedes Experiment ist eine Standardkurve erforderlich. Sie können eine neue Standardkurve erstellen oder Standards aus einem zuvor durchgeführten Experiment importieren.
• Um eine zuvor ausgeführte Standardkurve zu importieren, klicken Sie im Einrichtungsbildschirm der Anwendung auf die Option Load standards (Standards laden), wählen Sie eine zuvor ausgeführte Standardkurve und drücken auf Save (Speichern).
• Bereiten Sie Standards und unbekannte Proben auf die gleiche Weise vor. Beachten Sie die Richtlinien und Empfehlungen des Kit-Anbieters.
–Alle Referenz- und Standardlösungen sollten im gleichen Puffer vorliegen, der zum Resuspendieren der Proben verwendet wurde, sowie im gleichen Volumen an Reagenz, das den Proben zugesetzt wurde.
–Der erste Standard kann als Referenzmessung dienen. Die Referenzlösung sollte keinen der Analyten von Interesse enthalten. (Die Referenzmessung ist nicht dasselbe wie eine Leerwertmessung. Diese Anwendung erfordert beides.)
–Der Konzentrationsbereich der Standards muss den dynamischen Bereich des Assays und den erwarteten Bereich der unbekannten Proben abdecken. Die Analytkonzentrationen der Probe werden nicht über die Konzentration des höchsten Standards hinaus extrapoliert.
• Verwenden Sie die Option Setup Standards (Standards einrichten)auf dem Einrichtungsbildschirm der Anwendung, um Konzentrationswerte für die Standards einzugeben und anzugeben, wie Standards und Proben gemessen werden (Anzahl der Wiederholungen, Kurventyp usw.).
–Je nach der Einstellung von Curve Type (Kurventyp) kann eine Standardkurve unter Verwendung von zwei oder mehr Standards generiert werden.
–Die Software erfordert eine Referenzmessung und erlaubt bis zu 7 Standards.
–Die Konzentrationswerte der Standards können in beliebiger Reihenfolge eingegeben werden, aber die Standards müssen in der Reihenfolge gemessen werden, in der sie eingegeben wurden; die bewährte Praxis schreibt jedoch vor, dass die Standards von der niedrigsten bis zur höchsten Konzentration des Standard-Analyt-Stamms gemessen werden.
• Für alle kolorimetrischen Assays außer Protein Pierce 660 ist mit dem Gerät eine Leerwertmessung mit DI H2O (deionisiertes Wasser) durchzuführen. Für Protein Pierce 660 eine Leerwertmessung mit der Referenzlösung durchführen (siehe unten).
• Messen Sie den Referenzstandard und alle Standards, bevor Sie mit der Analyse von Proben beginnen. An der Standardkurve können nach der Messung der ersten Probe keine weiteren Änderungen vorgenommen werden.
Während Sie die Standards messen, wird ein Messbildschirm angezeigt, der ähnlich wie der Messbildschirm für Proben aufgebaut ist.
Wenn Sie die PC-Steuerungssoftware verwenden, gehen Sie auf die Registerkarte Curve (Kurve), um zu sehen, wie die Standardkurve erstellt wird.
Der R2-Wert gibt an, wie gut die Standardkurve zu den Standarddatenpunkten passt (1,0 bedeutet eine perfekte Anpassung, d. h. alle Punkte liegen genau auf der Kurve).
Nachdem die Mindestanzahl an Standards für den ausgewählten Kurventyp gemessen wurden, wird eine Meldung, ähnlich der folgenden angezeigt:
Standards neu messen: Zurückkehren zum Standardmessbildschirm, auf dem zuvor gemessene Standards ausgewählt und erneut gemessen werden können.
–Vom Bildschirm zur Messung der Standards, der Standardkurve oder der Standarddatentabelle aus halten Sie die Zeile gedrückt, um das Feld Sample Details (Probendetails) anzuzeigen.
–Wählen Sie Remeasure (Erneut messen) und dann Yes (Ja), um zu bestätigen.
Weitere Standards laden: zurück zum Einrichtungsbildschirm, auf dem Sie den Konzentrationswert für einen beliebigen Standard hinzufügen oder bearbeiten können. Wählen Sie anschließend Save (Speichern), um zu messen. Diese Option steht nicht zur Verfügung, wenn Sie bereits die maximal zulässige Anzahl an Standards gemessen haben.
Measure samples (Proben messen): Wechselt zum Probenmessbildschirm, danach können die Standards nicht mehr bearbeitet werden.
Note Sie können einen Standard jederzeit vor der Auswahl von Measure Samples (Proben messen) hinzufügen, bearbeiten oder löschen. |
Standard hinzufügen:
–Vom Standards-Messbildschirm aus, wählen Sie .
–Wählen Sie das nächste leere Konzentrationsfeld und geben Sie den Konzentrationswert für den neuen Standard ein.
–Wählen Sie Save (Speichern).
Standard bearbeiten:
–Vom Standards-Messbildschirm aus, wählen Sie .
–Wählen Sie das Feld Concentration (Konzentration) aus und bearbeiten Sie den Konzentrationswert.
–Wählen Sie Save (Speichern).
–Vom Bildschirm zur Messung der Standards, der Standardkurve oder der Standarddatentabelle aus halten Sie die Zeile gedrückt, um das Feld Standard Details (Standarddetails) anzuzeigen.
–Wählen Sie .
–Wählen Sie Yes (Ja), um zu bestätigen.
Der Standard wird in der Tabelle auf dem Messbildschirm nicht mehr angezeigt und sein Konzentrationswert erscheint nicht mehr auf dem Einrichtungsbildschirm.
Note Mit dieser Methode können Sie die Referenzmessung löschen; allerdings muss unmittelbar danach eine neue Referenz gemessen werden. |
• Nachdem alle Standards für den ausgewählten Kurventyp gemessen wurden, wird die Meldung „Standards Completed (Standards abgeschlossen)“ angezeigt. Wenn die Meldung „Invalid Standard (Ungültige Standards)“ erscheint, nachdem alle eingegebenen Standards gemessen worden sind, versuchen Sie:
–Auswählen eines anderen Kurventyps
–erneute Messung der Standards unter Verwendung des richtigen Standardmaterials
Note Diese Meldung ist lediglich ein Indikator dafür, dass die erforderliche Mindestanzahl an Punkten für den ausgewählten Kurventyp ermittelt wurde. Die Integrität der Kurve wird dadurch nicht bestätigt. Beispielsweise können zusätzliche Standards erforderlich sein, um den erwarteten Assay-Konzentrationsbereich abzudecken. |