Die Protein E280 Pro-Anwendung verwendet die Beer-Lambert-Gleichung zur Korrelation der Extinktion mit der Konzentration. Das Auflösen des Beersch'en Gesetzes nach der Konzentration ergibt die Gleichung rechts.
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Beer-Lambert-Gleichung (aufgelöst nach Konzentration) c = A / (e * b) Wobei: A = UV-Extinktion in Extinktionseinheiten (A) e = wellenlängenabhängiger molarer Absorptionskoeffizient (oder Extinktionskoeffizient) in Litern/mol-cm c = Analytkonzentration in Mol/Liter oder Stoffmengenkonzentration (M) Hinweis: Die Division der gemessenen Extinktion einer Probenlösung durch ihren molaren Extinktionskoeffizienten ergibt die molare Konzentration der Probe. Siehe Published Extinction Coefficients (Veröffentlichte Extinktionskoeffizienten) für weitere Informationen zu den Werten der Molarekonzentration im Vergleich zur Massenkonzentration.
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Der Extinktionskoeffizient eines Peptids oder Proteins hängt mit seiner Zusammensetzung der Aminosäuren Tryptophan (W), Tyrosin (Y) und Tipp: Der Extinktionskoeffizient ist für jedes Protein wellenlängenspezifisch und kann durch Puffertyp, Ionenstärke und pH-Wert beeinflusst werden. |
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Extinktionskoeffizienten für Proteine Bei 280 nm wird der Extinktionskoeffizient durch die gewichtete Summe der molaren Extinktionskoeffizienten der drei konstituierenden Aminosäuren bei 280 nm näherungsweise ermittelt, wie in dieser Gleichung beschrieben: e = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125) wobei: |
Diese Anwendung bietet sechs Optionen (siehe rechts) zur Auswahl eines geeigneten Extinktionskoeffizienten für jede gemessene Probe, der in Verbindung mit dem Beersch'en Gesetz zur Berechnung der Probenkonzentration verwendet werden kann. Wenn der Extinktionskoeffizient der Probe bekannt ist, wählen Sie die Option e + MW (molar) oder e1% (Masse) aus und geben Sie den Wert ein. Andernfalls berechnen Sie den Extinktionskoeffizienten oder wählen Sie die Option, die der Probenlösung am besten entspricht. Tipp: Idealerweise sollte der Extinktionskoeffizient empirisch unter Verwendung einer Lösung des Forschungsproteins in bekannter Konzentration im gleichen Puffer bestimmt werden.
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Verfügbare Optionen für den Extinktionskoeffizienten • 1 Ext. = 1 mg/ml, wobei Probentyp und/oder Extinktionskoeffizient unbekannt sind (ergibt eine grobe Schätzung der Proteinkonzentration) • BSA (Rinderserumalbumin, 6,7 l/gm-cm) • IgG (beliebiger Säugetierantikörper, 13,7 l/gm-cm) • Lysozym (Eiweiß-Lysozym, 26,4 l/gm-cm) • Anderes Protein (e + MW), benutzerspezifischer molarer Extinktionskoeffizient • Anderes Protein (e1 %), benutzerspezifischer Massenextinktionskoeffizient Hinweis: Weitere Informationen finden Sie unter Sample Type (Probentyp). |
Die berechneten Proteinkonzentrationen basieren auf dem Extinktionswert bei 280 nm, dem ausgewählten (oder eingegebenen) Extinktionskoeffizienten und der Schichtdicke der Probe. Eine Einzelpunkt-Basislinienkorrektur (oder -Analysenkorrektur) kann ebenfalls angewendet werden. Die Konzentration wird in Masseneinheiten angegeben. Zur Umrechnung der Konzentration von Masse in Mol-Einheiten auf der Grundlage der Probensequenz stehen im Internet Rechner zur Verfügung.
Die Extinktionswerte bei 260 nm und 280 nm werden zur Berechnung der Reinheitsverhältnisse für die gemessenen Nukleinsäureproben verwendet. Verunreinigungen in der Probe, |
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Hinweis: Mikrovolumen-Extinktionsmessungen werden auf eine 10-mm-äquivalente Schichtdicke normiert.
• Die Protein-Extinktionswerte werden bei 280 nm unter Verwendung des normierten Spektrums gemessen. Wenn die Basislinienkorrektur nicht ausgewählt wird, ist dies der berichtete E280-Wert und der Wert, der zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet wird. • Wenn Baseline Correction (Basislinienkorrektur) ausgewählt ist, wird der normierte und Basislinien-korrigierte Extinktionswert bei 280 nm berichtet und zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet. E260 Extinktion
• Zur Berechnung der E260/E280-Verhältnisse wird der normierte und Basislinien-korrigierte (falls ausgewählt) Extinktionswert bei 260 nm verwendet.
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• Proteinkonzentration. Wird in der ausgewählten Einheit angegeben (mg/ml oder μg/ml). Die Berechnungen basieren auf der Beer-Lambert-Gleichung unter Verwendung des korrigierten Protein-Extinktionswerts. • Reinheitsverhältnis E260/E280. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 280 nm. Ein E260/E280-Reinheitsverhältnis von ca. 0,57 wird für Proteine im Allgemeinen als „rein“ angesehen. Hinweis: Obwohl Reinheitsverhältnisse wichtige Indikatoren für die Probenqualität sind, ist der beste Indikator für die Proteinqualität die Funktionalität der nachgeschalteten Anwendung von Interesse (z. B. Echtzeit-PCR). • Probentyp. Bestimmt den Extinktionskoeffizienten, der in Verbindung mit dem Beer'schen Gesetz zur Berechnung der Probenkonzentration verwendet wird. • R2 (280 nm). Bestimmtheitskoeffizient für die Linie der besten Anpassung für 280-nm-Messungen. • Basislinienkorrektur. Die für die Basislinienkorrektur ausgewählte Wellenlänge und die bei dieser Wellenlänge ermittelte Extinktion. • Messort. Zeigt an, dass die Messung auf dem Messplatz durchgeführt wurde. • Wellenlängenüberwachung. Geben Sie eine weitere Wellenlänge ein, deren Extinktionswert in den Bericht aufgenommen werden soll. • Massenextinktionskoeffizient (1%ige Lösung). • Molarer Extinktionskoeffizient.
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