Für die dsDNA-, RNA- und Protein-E280-Anwendungen initiiert die NanoDrop Ultra-Software während der Messung automatisch eine Spektralanalyse für mehrere bekannte Verunreinigungen. Beispiele für bekannte Verunreinigungen sind:
• Für dsDNA und RNA Messungen:
–In der Analyseregion: Protein und Phenol
–erkennt das Vorhandensein von Guanidinhydrochlorid und Guanidiniumisothiocyanat
–erkennt das Vorhandensein eine artspezifische dsDNA-Kontamination in der RNA-Anwendung und erkennt eine artspezifische RNA-Kontamination in der dsDNA-Anwendung
• Für Protein-Messungen:
–In der Analyseregion: Nukleinsäuren und Phenol
Wenn in einer Probe Verunreinigungen festgestellt werden, erscheint links neben den Messergebnissen das Symbol „Verunreinigungsanalyse“.
Tippen Sie auf das Symbol, um die Verunreinigungsanalyse und die zugehörigen Informationen anzuzeigen.
Nachfolgend finden Sie ein Beispiel für die Ergebnisse einer Nukleinsäure-Verunreinigungsanalyse, die genügend Proteinverunreinigungen enthält, um die Messergebnisse zu beeinflussen.
1Basierend auf der Gesamtextinktion der Probe (Probe plus Verunreinigung)
2Basierend auf der korrigierten Extinktion der Probe (Probe abzüglich Verunreinigung)
Da Proteine nahe der Analysewellenlängen für Nukleinsäuren (230 nm, 260 nm und 280 nm) Licht absorbieren, hat das Vorhandensein von Protein in der oben gezeigten Probe die E260/E280- und E260/E230-Verhältnisse aus dem Bereich gedrängt und dafür gesorgt, dass die angegebene Nukleinsäurekonzentration höher ist als der tatsächliche Wert. Mit der Software wird die Verunreinigung (Protein) identifiziert und Folgendes gemeldet:
• Basislinienkorrigierte Extinktion aufgrund von Protein (0,18) bei der Analysewellenlänge (260 nm)
• % Variationskoeffizient für das Messergebnis (Unsicherheit x 100/Messergebnis = 14,03 %; ein hoher %VK zeigt an, dass das Messergebnis nahe an der Nachweisgrenze des Geräts liegt oder dass eine Störkomponente vorhanden ist)
• ursprüngliche Nukleinsäurekonzentration (59,5 ng/µl), die auf der gesamten basislinienkorrigierten Extinktion (Probe plus Verunreinigung) der Analysewellenlänge basiert
• korrigierte Nukleinsäurekonzentration (49,5 ng/µl), die auf der korrigierten Extinktion (Probe minus Verunreinigung) der Analysewellenlänge basiert
Theorie der Verunreinigungsanalyse
UV- und UV-Vis-Extinktionsmessungen werden zur Quantifizierung von Nukleinsäure- und Proteinproben bei 260 nm bzw. 280 nm verwendet. Die Analyse basiert auf der Tatsache, dass die Gesamtabsorption einer Mischlösung bei einer bestimmten Wellenlänge die Summe der Extinktionswerte jeder Komponente in der Mischung ist.
Die Herausforderung bei dieser Methode besteht darin, dass eine Reihe von Materialien, die im Extraktionsprozess verwendet werden, in verschiedenen Bereichen des Spektrums absorbieren können. Wenn diese Verunreinigungen in einer Probe vorhanden sind, können sie die Analyse stören, indem sie die Extinktion im relevanten Wellenlängenbereich künstlich erhöhen, wodurch die Analytkonzentration überschätzt wird.
Üblicherweise werden die Reinheitsverhältnisse verwendet, um das Vorhandensein von Verunreinigungen festzustellen, die nachgelagerte Anwendungen beeinträchtigen könnten. Reinheitsverhältnisse geben jedoch nicht immer ein vollständiges Bild der möglichen Verunreinigungen. Wenn ein Reinheitsverhältnis außerhalb des erwarteten Bereichs liegt, wird das Spektralprofil oft qualitativ untersucht.
Unsere Acclaro-Technologie wendet einen quantitativen Ansatz bei der Verunreinigungsanalyse an. Acclaro analysiert die Spektraldaten mithilfe hochentwickelter mathematischer Algorithmen, um wahrscheinliche Verunreinigungen in einer Probe zu identifizieren, und entfernt alle Beiträge, die auf die Verunreinigung zurückzuführen sind, aus dem Probenergebnis. Dadurch ergibt sich ein genauerer Konzentrationswert des betreffenden Analyten und eine genauere quantitative Analyse des Verunreinigungsgrads.
Da das Spektrum einer reinen Verbindung für diese Verbindung einmalig ist, kann ein Mischungsspektrum aus zumeist bekannten Materialien, die wenige Wechselwirkungen aufweisen, mathematisch in seine Teilspektren und die identifizierten Komponenten zerlegt werden. Der Algorithmus für die Verunreinigungsanalyse verwendet einen schmalen Spektralbereich (220–285 nm) um die Analysewellenlänge (260 nm für Nukleinsäuren, 280 nm für Proteine) herum, um den Extinktionsbeitrag möglicher bekannter Verunreinigungen (Proteine oder Nukleinsäuren und Phenol) zu bestimmen, die in diesem Bereich absorbieren. Das gesamte Spektrum wird analysiert, um das Vorhandensein anderer möglicher Verunreinigungen wie Guanidin-HCl und/oder Guanidiniumisothiocyanat festzustellen, bei denen es sich um gängige Reagenzien handelt, die für die Nukleinsäureaufreinigung verwendet werden.