Berechnungen für Mikroarray-Messungen
Wie die anderen Nukleinsäure-Anwendungen verwendet die Anwendung „Mikroarray“ eine Modifikation der Beer-Lambert-Gleichung , um die Probenkonzentration zu berechnen. Dabei werden der Extinktionskoeffizient und die Schichtdicke kombiniert und als ein „Faktor“ bezeichnet. Die Anwendung „Mikroarray“ bietet sechs Optionen (rechts gezeigt) zur Auswahl eines geeigneten Faktors für jede gemessene Probe, die in Verbindung mit dem Beer’schen Gesetz verwendet wird, um die Probenkonzentration zu berechnen. Wenn der Faktor bekannt ist, wählen Sie die Option Benutzerdefinierter Faktor und geben Sie den Faktor in ng-cm/µl ein. Andernfalls wählen Sie die Option, die der Probenlösung am ehesten entspricht. Tipp: Im Idealfall sollte der Faktor oder Extinktionskoeffizient empirisch unter Verwendung einer Studiennukleinsäure mit einer bekannten Konzentration unter Verwendung des gleichen Puffers bestimmt werden. |
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• dsDNA (Faktor = 50 ng-cm/µl) • ssDNA (Faktor = 33 ng-cm/µl) • RNA (Faktor = 40 ng-cm/µl) • Oligo-DNA (berechnet aus der vom Benutzer eingegebenen DNA-Nukleotidsequenz) • Oligo-RNA (berechnet aus der vom Benutzer eingegebenen DNA-Nukleotidsequenz) • Benutzerdefinierter Faktor (vom Benutzer eingegebener Faktor zwischen 15 ng-cm/µl und 150 ng-cm/µl) Hinweis: Weitere Informationen finden Sie unter Probentyp. |
Die berechneten Nukleinsäurekonzentrationen werden auf der Grundlage des Extinktionswerts bei 260 nm, des verwendeten Faktors und der Schichtdicke der Probe berechnet. Eine Einzelpunkt-Basislinienkorrektur (oder Analysenkorrektur) kann ebenfalls angewendet werden. Die Konzentration wird in Masseeinheiten angegeben. Zur Umrechnung der Konzentration von Masse in Mol-Einheiten auf der Grundlage der Probensequenz stehen im Internet Rechner zur Verfügung. Die Extinktionswerte bei 260 nm, 280 nm und manchmal 230 nm werden zur Berechnung der Reinheitsverhältnisse für die gemessenen Nukleinsäureproben verwendet. Verunreinigungen in der Probe, wie z. B. Lösungsmittelrückstände und Reagenzien, die typischerweise bei der Probenreinigung verwendet werden, wirken sich auf die Reinheitsverhältnisse aus.
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Messwerte Hinweis: Der Extinktionswert bei 850 nm wird von allen Wellenlängen im Probenspektrum subtrahiert. Daher ist die Absorption bei 850 nm in den angezeigten Spektren gleich Null. Bei Mikrovolumen-Extinktionsmessungen und Messungen mit nicht standardisierten Küvetten (andere Küvetten als 10 mm-Küvetten) werden die Spektren auf eine 10-mm-äquivalente Schichtdicke normiert.
• Die Nukleinsäure-Extinktionswerte für alle Mikroarray-Probentypen werden bei 260 nm unter Verwendung des 850-korrigierten und normalisierten Spektrums gemessen. • Wenn die Analysenkorrektur ausgewählt ist, wird der Extinktionswert bei der Korrekturwellenlänge von der Extinktion bei 260 nm subtrahiert. • Wenn ein oder mehrere Farbstoffe ausgewählt wurden, werden die Farbstoffkorrekturwerte bei 260 nm ebenfalls von der Extinktion 260 nm subtrahiert. • Die korrigierte Extinktion bei 260 nm wird angegeben und zur Berechnung der Nukleinsäurekonzentration verwendet. • Der auf 850 korrigierte und normalisierte Extinktionswert bei 280 nm (abzüglich der E280-Farbstoffkorrektur) wird zur Berechnung des E260/E280-Verhältnisses verwendet. |
Die Farbstoffkonzentrationen werden aus dem Extinktionswert der Wellenlänge des Farbstoffs bei der Analyse, dem Extinktionskoeffizienten des Farbstoffs und der Schichtdicke der Probe berechnet.
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• Farbstoff-Extinktionswerte werden bei bestimmten Wellenlängen gemessen. Siehe Farbstoff/Chromophor-Editor für die verwendeten Analysewellenlängen. • Die mit Basislinienkorrektur bereinigten Extinktionswerte werden aufgezeichnet und zur Berechnung der Farbstoffkonzentrationen verwendet. Farbstoffkorrektur • Vordefinierte Farbstoffe haben bekannte Korrekturwerte für E260 und E280. Siehe Farbstoff/Chromophor-Editor für die verwendeten Korrekturwerte.
• E260-Farbstoffkorrekturen werden vom E260-Extinktionswert subtrahiert, um die Nukleinsäurekonzentration zu berechnen. Der E260-Extinktionswert wird verwendet, um die E260/E280.-Reinheitsverhältnisse zu berechnen |
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Probenschichtdicke • Die Software wählt für Messungen von Mikrovolumen die optimale Schichtdicke, (zwischen 1,0 mm und 0,03 mm) basierend auf der Extinktion der Probe bei der Analysewellenlänge aus. • Bei Küvettenmessungen wird die nach dem Umschalten in den Küvettenmodus ausgewählte Schichtdicke verwendet. (siehe Küvetten-Einstellungen). • Die dargestellten Spektren und Extinktionswerte sind auf eine äquivalente Schichtdicke von 10 mm normiert. |
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• Nukleinsäurenkonzentration. Angabe in ausgewählten Einheiten (d. h. ng/µl, µg/µl oder µg/ml). Die Berechnungen basieren auf der modifizierten Gleichung des Beer'schen Gesetzes unter Verwendung des korrigierten Absorptionswerts der Nukleinsäuren.
• E260/E280 Reinheitsverhältnis. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 280 nm. Ein Reinheitsverhältnis von E260/E280 von ~1,8 wird im Allgemeinen als „rein“ für DNA angesehen (~2,0 für RNA). Saure Lösungen können den angegebenen Wert um 0,2–0,3 zu niedrig darstellen; das Gegenteil gilt für basische Lösungen. • Farbstoff1/Farbstoff2-Konzentration. Angabe in pmol/µl. Die Berechnungen basieren auf der Gleichung des Beer'schen Gesetzes unter Verwendung von Extinktionswerten mit Basislinienkorrektur.
Hinweis: Obwohl Reinheitsverhältnisse wichtige Indikatoren für die Probenqualität darstellen, ist der beste Indikator für die DNA- oder RNA-Qualität die Funktionalität in der nachgeschalteten relevanten Anwendung (z. B. Mikroarray).
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• Berechnungen für Nukleinsäure-Messungen