Bewährte Methoden für Fluoreszenzmessungen

Im Falle von nicht getesteten kontaminierenden Substanzen und für höchste Genauigkeit sollten die Standards unter den gleichen Bedingungen wie die Versuchsproben getestet werden.

Isolieren und reinigen Sie Nukleinsäureproben vor der Messung, um Verunreinigungen zu entfernen. Je nach Probe kann es sich bei den Verunreinigungen um DNA, RNA, freie Nukleotide, Proteine, bestimmte Pufferkomponenten und Farbstoffe handeln. Weitere Informationen finden Sie unter Probenvorbereitung.

Stellen Sie sicher, dass die Probenkonzentration innerhalb der Grenzwerte des ausgewählten Assays liegt.

Der NanoDrop Ultra Fluoreszenz-Assay liefert bei Raumtemperatur (18–28 °C) aller Lösungen optimale Ergebnisse. Temperaturschwankungen können die Genauigkeit der Assays beeinflussen.

Stellen Sie sicher, dass die Oberflächen des Messplatzes ordnungsgemäß gereinigt und konditioniert wurden.

Vortexen und zentrifugieren, bevor eine Messung durchgeführt wird. Vermeiden Sie beim Mischen und Pipettieren Blasenbildung.

Halten Sie sich an bewährte Methoden für Messungen von Mikrovolumen.

Verwenden Sie ein Probenvolumen von 2 µl. Weitere Informationen finden Sie unter „Empfohlene Probenvolumina“.

Sie haben bei jedem Experiment die Möglichkeit, eine neue Standardkurve zu erstellen oder die Werte einer bereits vorhandenen Standardkurve zu verwenden. Es wird dringend empfohlen, für jeden neuen Durchlauf eine neue Kalibrierung vorzunehmen, um Leistungsbeeinträchtigungen durch Variablen zu minimieren.

Es liegen derzeit keine Daten vor, die sich mit der Mutagenität oder Toxizität der NanoDrop™ Ultra dsDNA BR Fluoreszenzreagenzien (der Farbstoff in Komponente A) auseinandersetzen. Es ist bekannt, dass diese Reagenzien sich an Nukleinsäuren binden. Behandeln Sie Puffer mit den gleichen Sicherheitsmaßnahmen wie alle anderen potenziellen Mutagene und entsorgen Sie den Farbstoff gemäß den örtlichen Vorschriften.

Der NanoDrop™ Ultra RNA HS Fluoreszenz-Assay enthält einen hochwertigen rRNA-Standard. Diese Standards müssen unbedingt in ihrer Gesamtheit und in ihrer Konzentration beibehalten werden, um eine optimale Leistung zu erzielen. Daher empfehlen wir dringend, die rRNA-Standards mit der gleichen Sorgfalt zu behandeln wie jede andere RNA. Dies beinhaltet:

Verwendung von geeignete RNAse-freie Arbeitstechniken,
wie z. B. RNAse-freie Handschuhe, Pipettenspitzen und Röhrchen.

Halten Sie die Deckel der Röhrchen möglichst immer geschlossen.

Achten Sie darauf, dass Sie bei der Entnahme einer Probe nicht die Innenwand des Röhrchens berühren.

Nach Gebrauch wird empfohlen, den rRNA-Standard umgehend wieder in den Kühlschrank zu legen.

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Messen einer Mikrovolumenprobe

Bewährte Methoden für Mikrovolumenmessungen

Grundlegende Gerätefunktionen

 

Arbeiten mit Standardkurven

Für die Fluoreszenzanalyse ist eine Standardkurve erforderlich.

Für jedes Experiment ist eine Standardkurve erforderlich. Sie können eine neue Standardkurve erstellen oder Standards aus einem zuvor durchgeführten Experiment importieren.

Um eine zuvor gemessene Standardkurve zu importieren, klicken Sie im Einstellungen-Bildschirm der Anwendung auf die Option Load standards (Standards aufzeigen), markieren Sie eine zuvor gemessene Standardkurve und drücken Sie auf Save (Speichern).

Um eine neue Standardkurve zu erstellen, wählen Sie im Einstellungen-Bildschirm der Anwendung die Option Setup standards (Standards einstellen) aus. Nehmen Sie alle erforderlichen Änderungen an den anwendungsspezifischen Einstellungen vor und wählen Sie dann Save (Speichern).

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Note  Für die NanoDrop Ultra BR- und HS-Fluoreszenzassays sind 2 Standards erforderlich.

Messen Sie alle Standards bevor Sie mit der Analyse von Proben beginnen. An der Standardkurve können nach der Messung der ersten Probe keine weiteren Änderungen vorgenommen werden.

Während Sie die Standards messen, erscheint ein Dialogfeld, das den Benutzer auffordert, die verbleibenden Standards zu messen.

CH6_Image_1.png

 

Wischen Sie auf dem Bildschirm nach links, um die Standardkurve zu sehen, während Sie sie erstellen. Hier finden Sie einBeispiel:

CH6_Image_2.png

 

Die Fluorometer-Anwendung ermittelt einen R2-Wert, der angibt, wie gut die Standardkurve zu den Standarddatenpunkten passt (1,0 bedeutet eine perfekte Passung, d. h. alle Punkte liegen genau auf der Kurve).

Wischen Sie auf dem Bildschirm nach links, um die Datentabelle für die Standards anzuzeigen. Hier finden Sie einBeispiel:

CH6_Image_3.png

 

Drücken und halten Sie eine Zeile in einem der vorherigen Bildschirme, um Details zu einem bestimmten Standard anzuzeigen. Hier ist ein Beispiel:

CH6_Image_4.png

 

Nachdem die beiden Standards für den ausgewählten Kurventyp gemessen wurden, wird eine Meldung, ähnlich der folgenden angezeigt:

CH6_Image_5.png

 

Standards wiederholen: Zurückkehren zum Standardmessbildschirm, auf dem zuvor gemessene Standards ausgewählt und erneut gemessen werden können.

Von dem Bildschirm mit der Standardkurve oder der Standarddatentabelle aus drücken und halten Sie die Zeile des Standards, der erneut gemessen werden soll, um das Feld Sample Details (Probendetails) anzuzeigen.

Tippen Sie auf Remeasure (Erneut messen).

Mehr Standards laden: Zurück zum Einstellungen-Bildschirm, wo Sie weitere Standards zur Messung hinzufügen können. Insgesamt können 1 Referenz und 7 Standards verwendet werden. Diese Option wird nicht angezeigt, wenn Sie die Anwendungen dsDNA-Fluoreszenz oder RNA-Fluoreszenz verwenden, da diese Anwendungen 2 Standards erfordern.

Measure samples (Proben messen): Weiter zum Bildschirm Probenmessung.

Note  Nachdem beide Standards gemessen wurden, sollte die Meldung „Standards Completed (Standards fertiggestellt)“ erscheinen. Falls die Meldung „Invalid Standards (Ungültige Standards)“ angezeigt wird, nachdem alle Standards gemessen wurden, versuchen Sie, die Standards mit dem richtigen Standardmaterial erneut zu messen.