Die Nukleinsäureanwendungen verwenden eine Modifikation der Beer-Lambert-Gleichung (siehe rechts), um die Probenkonzentration zu berechnen, bei der der Extinktionskoeffizient und die Schichtdicke kombiniert und als „Faktor“ bezeichnet werden. |
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Extinktionskoeffizienten vs. Faktoren Unter Verwendung der Terme in der Beer-Lambert-Gleichung wird Faktor (f) wie folgt definiert: Faktor (f) = 1/(e * b) wobei: Als Ergebnis wird die Analytkonzentration (c) wie folgt berechnet: c = A * [1/(e * b)] oder c = A * f wobei: |
Für die dsDNA-, ssDNA- und RNA-Anwendungen werden die allgemein anerkannten Faktoren für Nukleinsäuren in Verbindung mit dem Beer'schen Gesetz verwendet, um die Probenkonzentration zu berechnen. Für die Anwendung Custom Factor (Benutzerspezifischer Faktor) wird der vom Benutzer angegebene Faktor verwendet. |
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• dsDNA (Faktor = 50 ng-cm/µl) • ssDNA (Faktor = 33 ng-cm/µl) • RNA (Faktor = 40 ng-cm/µl) • Custom Factor (Benutzerdefinierter Faktor) (vom Benutzer eingegebener Faktor zwischen 15 ng-cm/µl und 150 ng-cm/µl |
Die berechneten Nukleinsäurekonzentrationen werden auf der Grundlage des Extinktionswerts bei 260 nm, des verwendeten Faktors und der Schichtdicke der Probe berechnet. Eine Einzelpunkt-Basislinienkorrektur Die Konzentration wird in Masseneinheiten angegeben. Zur Umrechnung der Konzentration von Masse in Mol-Einheiten auf der Grundlage der Probensequenz stehen im Internet Rechner zur Verfügung. Extinktionswerte bei 260 nm, 280 nm und manchmal 230 nm werden verwendet, um die Reinheitsverhältnisse für die gemessenen Nukleinsäureproben zu berechnen. Verunreinigungen in der Probe, wie z. B. Lösungsmittelrückstände und Reagenzien, die typischerweise bei der Probenreinigung verwendet werden, wirken sich auf die Reinheitsverhältnisse aus.
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Messwert Hinweis: Bei Extinktionsmessungen von Mikrovolumina und Messungen mit nicht standardisierten Küvetten (andere Küvetten als 10 mm-Küvetten) werden die Spektren auf das Äquivalent einer 10 mm-Schichtdicke normalisiert.
• Die Extinktionswerte der Nukleinsäuren werden bei 260 nm unter Verwendung des normierten Spektrums gemessen. Dies ist der gemeldete E260-Wert, wenn Basislinienkorrektur nicht ausgewählt ist. • Wenn die Basislinienkorrektur ausgewählt ist, wird der Extinktionswert bei der Korrekturwellenlänge von der Extinktion bei 260 nm subtrahiert. Die korrigierte Extinktion bei 260 nm wird angegeben und zur Berechnung der Nukleinsäurekonzentration verwendet. • Zur Berechnung der Verhältnisse E260/E230 und E260/E280 werden die normierten und Basislinien-korrigierten (wenn ausgewählt) Extinktionswerte bei 230 nm und 280 nm verwendet. |
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• Die Software wählt für Messungen von Mikrovolumen die optimale Schichtdicke, (zwischen 1,0 mm und 0,03 mm) basierend auf der Extinktion der Probe bei der Analysewellenlänge aus. • Bei Küvettenmessungen wird die nach dem Umschalten in den Küvettenmodus ausgewählte Schichtdicke verwendet. (siehe Küvetteneinstellungen) • Die dargestellten Spektren und Extinktionswerte sind auf eine äquivalente Schichtdicke von 10 mm normiert.
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• Nukleinsäurenkonzentration. In der ausgewählten Einheit angegeben (d. h. ng/µl, μg/ul oder μg/ml). Die Berechnungen basieren auf der modifizierten Beer'schen Gleichung unter Verwendung des korrigierten Nukleinsäure-Extinktionswerts.
• Reinheitsverhältnis E260/E280. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 280 nm. Ein E260/E280-Reinheitsverhältnis von ca. 1,8 wird für DNA im Allgemeinen als „rein“ angesehen (ca. 2,0 für RNA). Saure Lösungen können um 0,2–0,3 unter dem berichteten Wert liegen; das Gegenteil trifft auf basische Lösungen zu.
• Reinheitsverhältnis E260/E230. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 230 nm. Ein E260/E230-Reinheitsverhältnis zwischen 1,8 und 2,2 wird für DNA und RNA im Allgemeinen als „rein“ angesehen. Hinweis: Obwohl Reinheitsverhältnisse wichtige Indikatoren für die Probenqualität sind, ist der beste Indikator für die Qualität die Funktionalität in der nachgeschalteten Anwendung von Interesse (z. B. Echtzeit-PCR). • Faktor. Wird in Verbindung mit dem Beer'schen Gesetz verwendet, um die Probenkonzentration zu berechnen • Contaminant (Verunreinigung) - Wenn eine Verunreinigung von der Acclaro-Software identifiziert wurde, wird die Verunreinigung in dieser Spalte angezeigt. • Faktor. Wird in Verbindung mit dem Beer'schen Gesetz verwendet, um die Probenkonzentration zu berechnen. • Basislinienkorrektur. Die für die Basislinienkorrektur ausgewählte Wellenlänge und die bei dieser Wellenlänge ermittelte Extinktion. • Messort. Zeigt an, ob die Messung auf dem Messplatz oder im Küvettenmodus durchgeführt wurde. • Wellenlängenüberwachung. Geben Sie eine weitere Wellenlänge ein, deren Extinktionswert in den Bericht aufgenommen werden soll. |
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• Verunreinigung. Wenn eine Verunreinigung von der Acclaro-Software identifiziert wurde, wird die Verunreinigung in dieser Spalte angezeigt. • Korrigiert. Zeigt die korrigierte Analytkonzentration an, die mit der Acclaro-Software bestimmt wurde, sofern verfügbar. • Arten. Die Arten der Nukleinsäure-Verunreinigungen, die von der Acclaro-Software erkannt werden • Kit-Name. Gibt den Namen des qPCR-Kits an, das verwendet wird, um die qPCR-Rezeptberechnungen zu bestimmen, sofern eine solche während der Einrichtung ausgewählt wurde. • Probenverdünnungsverhältnis. Wenn die Verdünnung der Probe vor der qPCR empfohlen wird, wird das Volumen der gemessenen Probe im Verhältnis zum Endvolumen der Verdünnung angezeigt. • Verdünnung erforderlich: Diluentvolumen (µl). Wenn die Verdünnung der Probe vor der qPCR empfohlen wird, wird das Volumen der ursprünglichen Nukleinsäureprobe angezeigt, das dem Verdünnungsröhrchen hinzugefügt werden muss. • Verdünnung erforderlich: Diluentvolumen (µl). Wenn die Verdünnung der Probe vor der qPCR empfohlen wird, wird das Volumen des Verdünnungsmittels angezeigt, das dem Verdünnungsröhrchen hinzugefügt werden muss. • Kit-Reaktion: Nukleinsäurevolumen (µl). Falls in denFeldern Dilution Required (Verdünnung erforderlich) keine Verdünnung empfohlen wird, gibt dies das Volumen der ursprünglichen Nukleinsäureprobe an, das dem qPCR-Reaktionsröhrchen hinzugefügt werden muss. Falls in den Feldern Dilution Required (Verdünnung erforderlich) keine Verdünnung empfohlen wurde, gibt dies das Volumen des Nukleinsäure-Verdünnungsröhrchens an, das zum qPCR-Reaktionsröhrchen hinzugefügt werden muss. • Kit-Reaktion: Wasservolumen (µl). Zeigt das Wasservolumen an, das in das qPCR-Reaktionsröhrchen gegeben werden soll. • Kit-Reaktion: Template-Endkonz. Zeigt die Konzentration der Nukleinsäureprobe an, nachdem sie dem qPCR-Reaktionsröhrchen hinzugefügt wurde. |
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• Rührer. „Off/Aus“ wird angezeigt, wenn die Rührfunktion bei einem Küvettenmodell nicht verwendet wird. Wenn die Rührerfunktion verwendet wird, wird die Rührergeschwindigkeit angezeigt. • Heizelement. Es wird „Off/Aus“ oder „On/Ein“ angezeigt, um zu zeigen, ob die Küvetten während der Messung beheizt wurde. • Gemessene Temperatur. Die Temperatur am Küvettenanschluss während der Messung wird angezeigt. • Zieltemperatur. Die gewünschte Temperatur am Küvettenanschluss wird angezeigt. |