Berechnungen

Die Protein E280 Pro-Anwendung verwendet die Beer-Lambert-Gleichung zur Korrelation der Extinktion mit der Konzentration. Das Auflösen des Beersch'en Gesetzes nach der Konzentration ergibt die Gleichung rechts.

 

 

Beer-Lambert-Gleichung (aufgelöst nach Konzentration)

c = A / (e * b)

Wobei:

A = UV-Extinktion in Extinktionseinheiten (A)

e = wellenlängenabhängiger molarer Absorptionskoeffizient (oder Extinktionskoeffizient) in Litern/mol-cm

b = Schichtdicke in cm

c = Analytkonzentration in Mol/Liter oder Stoffmengenkonzentration (M)

Hinweis: Die Division der gemessenen Extinktion einer Probenlösung durch ihren molaren Extinktionskoeffizienten ergibt die molare Konzentration der Probe. Siehe Published Extinction Coefficients (Veröffentlichte Extinktionskoeffizienten) für weitere Informationen zu den Werten der Molarekonzentration im Vergleich zur Massenkonzentration.

 

Der Extinktionskoeffizient eines Peptids oder Proteins hängt mit seiner Zusammensetzung der Aminosäuren Tryptophan (W), Tyrosin (Y) und
Cystein (C) zusammen.

Tipp: Der Extinktionskoeffizient ist für jedes Protein wellenlängenspezifisch und kann durch Puffertyp, Ionenstärke und pH-Wert beeinflusst werden.

 

Extinktionskoeffizienten für Proteine

Bei 280 nm wird der Extinktionskoeffizient durch die gewichtete Summe der molaren Extinktionskoeffizienten der drei konstituierenden Aminosäuren bei 280 nm näherungsweise ermittelt, wie in dieser Gleichung beschrieben:

e = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125)

wobei:
e = molarer Extinktionskoeffizient
n = Anzahl jedes Aminosäurerests
5500, 1490 und 125 = Molare Absorptivitäten von Aminosäure bei 280 nm

Diese Anwendung bietet sechs Optionen (siehe rechts) zur Auswahl eines geeigneten Extinktionskoeffizienten für jede gemessene Probe, der in Verbindung mit dem Beersch'en Gesetz zur Berechnung der Probenkonzentration verwendet werden kann.

Wenn der Extinktionskoeffizient der Probe bekannt ist, wählen Sie die Option e + MW (molar) oder e1% (Masse) aus und geben Sie den Wert ein. Andernfalls berechnen Sie den Extinktionskoeffizienten oder wählen Sie die Option, die der Probenlösung am besten entspricht.

Tipp: Idealerweise sollte der Extinktionskoeffizient empirisch unter Verwendung einer Lösung des Forschungsproteins in bekannter Konzentration im gleichen Puffer bestimmt werden.

 

 

Verfügbare Optionen für den Extinktionskoeffizienten

1 Ext. = 1 mg/ml, wobei Probentyp und/oder Extinktionskoeffizient unbekannt sind (ergibt eine grobe Schätzung der Proteinkonzentration)

BSA (Rinderserumalbumin, 6,7 l/gm-cm)

IgG (beliebiger Säugetierantikörper, 13,7 l/gm-cm)

Lysozym (Eiweiß-Lysozym, 26,4 l/gm-cm)

Anderes Protein (e + MW), benutzerspezifischer molarer Extinktionskoeffizient

Anderes Protein (e1 %), benutzerspezifischer Massenextinktionskoeffizient

Hinweis: Weitere Informationen finden Sie unter Sample Type (Probentyp).

 

Die meisten Quellen geben für Proteine Extinktionskoeffizienten an, die bei oder nahe an 280 nm in Phosphat oder einem anderen physiologischen Puffer gemessen werden. Diese Werte bieten eine ausreichende Genauigkeit für routinemäßige Bewertungen der Proteinkonzentration.

 

Veröffentlichte Extinktionskoeffizienten

Veröffentlichte Extinktionskoeffizienten für Proteine können wie folgt angegeben werden:

wellenlängenabhängiger molarer Absorptionskoeffizient (oder Extinktionskoeffizient) (e) mit Einheiten von M-1cm-1

prozentualer Extinktionskoeffizient der Lösung (e1 %) mit Einheiten von (g/100 ml)-1cm-1 (d. h. 1%ige oder 1 g/100-ml-Lösung, gemessen in einer 1-cm-Küvette)

Protein-Extinktionswerte für 0,1%ige (d. h. 1 mg/ml) Lösungen

Tipp: Bewerten Sie die veröffentlichten Werte sorgfältig, um sicherzustellen, dass die Maßeinheit korrekt verwendet wird.

Die Gleichung rechts zeigt die Beziehung zwischen dem molaren Extinktionskoeffizienten (emolar) und dem prozentualen Extinktionskoeffizienten (e1 %).

 

Umrechnung zwischen emolar und e1 %

(emolar) * 10 = (e1 %) * (MWProtein)

Beispiel: Bestimmung des prozentualen Lösungs-Extinktionskoeffizienten (e1 %) für ein Protein mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 43.824 M-1cm-1 und einer Molekularmasse (MW) von 66.400 Dalton (Da), die obige Gleichung wie folgt ordnen und lösen:

e1 % = (emolar * 10) / (MWprotein)

e1 % = (43.824 * 10) / 66.400 Da)

e1 % = 6,6 g/100 ml

Verwenden Sie die Gleichung rechts und einen Umrechnungsfaktor von 10, um die Konzentration (c) einer Probe in mg/ml zu bestimmen.

Tipp: Die NanoDrop Ultra-Software berücksichtigt den Umrechnungsfaktor bei der Meldung von Proteinkonzentrationen.

 

Umrechnungen zwischen g/100 ml und mg/ml

CProtein in mg/ml = (A /e1 %) * 10

Beispiel: Wenn die gemessene Extinktion für eine Proteinprobe bei 280 nm relativ zur Referenz 5,8 A beträgt, kann die Proteinkonzentration wie folgt berechnet werden:

CProtein = (A / e1 %) * 10

CProtein = (5,8/6,6 g/100 ml) * 10

CProtein = 8,79 mg/ml

 

Die berechneten Proteinkonzentrationen basieren auf dem Extinktionswert bei 280 nm, dem ausgewählten (oder eingegebenen) Extinktionskoeffizienten und der Schichtdicke der Probe. Eine Einzelpunkt-Basislinienkorrektur (oder -Analysenkorrektur) kann ebenfalls angewendet werden.

Die Konzentration wird in Masseneinheiten angegeben. Zur Umrechnung der Konzentration von Masse in Mol-Einheiten auf der Grundlage der Probensequenz stehen im Internet Rechner zur Verfügung.

 

 

Die Extinktionswerte bei 260 nm und 280 nm werden zur Berechnung der Reinheitsverhältnisse für die gemessenen Nukleinsäureproben verwendet.

Verunreinigungen in der Probe,
wie z. B. Lösungsmittelrückstände und Reagenzien, die typischerweise bei der Probenreinigung verwendet werden, wirken sich auf die Reinheitsverhältnisse aus.

 

Messwert

E280 Extinktion

Hinweis: Mikrovolumen-Extinktionsmessungen werden auf eine 10-mm-äquivalente Schichtdicke normiert.

 

Die Protein-Extinktionswerte werden bei 280 nm unter Verwendung des normierten Spektrums gemessen. Wenn die Basislinienkorrektur nicht ausgewählt wird, ist dies der berichtete E280-Wert und der Wert, der zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet wird.

Wenn Baseline Correction (Basislinienkorrektur) ausgewählt ist, wird der normierte und Basislinien-korrigierte Extinktionswert bei 280 nm berichtet und zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet.

E260 Extinktion

 

Zur Berechnung der E260/E280-Verhältnisse wird der normierte und Basislinien-korrigierte (falls ausgewählt) Extinktionswert bei 260 nm verwendet.

 

 

 

Berichtete Werte

Proteinkonzentration. Wird in der ausgewählten Einheit angegeben (mg/ml oder μg/ml). Die Berechnungen basieren auf der Beer-Lambert-Gleichung unter Verwendung des korrigierten Protein-Extinktionswerts.

Reinheitsverhältnis E260/E280. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 280 nm. Ein E260/E280-Reinheitsverhältnis von ca. 0,57 wird für Proteine im Allgemeinen als „rein“ angesehen.

Hinweis: Obwohl Reinheitsverhältnisse wichtige Indikatoren für die Probenqualität sind, ist der beste Indikator für die Proteinqualität die Funktionalität der nachgeschalteten Anwendung von Interesse (z. B. Echtzeit-PCR).

Probentyp. Bestimmt den Extinktionskoeffizienten, der in Verbindung mit dem Beer'schen Gesetz zur Berechnung der Probenkonzentration verwendet wird.

R2 (280 nm). Bestimmtheitskoeffizient für die Linie der besten Anpassung für 280-nm-Messungen.

Basislinienkorrektur. Die für die Basislinienkorrektur ausgewählte Wellenlänge und die bei dieser Wellenlänge ermittelte Extinktion.

Messort. Zeigt an, dass die Messung auf dem Messplatz durchgeführt wurde.

Wellenlängenüberwachung. Geben Sie eine weitere  Wellenlänge ein, deren Extinktionswert in den Bericht aufgenommen werden soll.

Massenextinktionskoeffizient (1%ige Lösung).

Molarer Extinktionskoeffizient.

Molekülmasse.