OD600

Misst die Konzentration mikrobieller Zellkulturen in Lösung durch Messung der Lichtstreuung bei 600 nm.

OD600-Messung

Berichtete Ergebnisse

Einstellungen

Berechnungen

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Theorie hinter der OD600-Anwendung

Die OD600-Anwendung misst die Lichtübertragung und berechnet anhand dieses Werts die Extinktion. In der Spektroskopie wird als übertragenes Licht als jegliches Licht definiert, das nicht von einer Probe absorbiert, reflektiert oder gestreut wird.

Bei lebenden Zellen wird der größte Teil des einfallenden Lichts durch die Probe hindurchgelassen, anstatt gestreut, reflektiert oder absorbiert zu werden. Die Menge an gestreutem Licht ist gering und kann von Gerät zu Gerät variieren. Daher sind die berechneten Extinktionswerte typischerweise sehr niedrig.

Die berechneten Extinktionswerte werden verwendet, um die Dichte der Zellen in Lösung in Zellen/ml zu bestimmen. Zu den physischen Konzepten und Formeln, die die optischen Eigenschaften lebender Zellen mit der Konzentration in Verbindung bringen, gehören:

Zellen, die einen anderen Refraktionsindex als das umgebende Medium aufweisen, reflektieren und streuen zufällig Licht aus dem Weg des einfallenden Lichts. Das Ausmaß der Streuung ist proportional zur Zelldichte in der Probe.

Die Beer'sche Gleichung wird verwendet, um die Extinktion mit der Konzentration in Beziehung zu setzen. Siehe Berechnungen für OD600-Messungen, um weitere Informationen zu erhalten.

Für die Küvettenmessung mit NanoDrop Ultrac und NanoDrop Ultrac FL-Geräten liegen die genauen Extinktionswerte typischerweise im Bereich zwischen 0,04 A und 1,5 A. Normalerweise sind serielle Verdünnungen der Probe erforderlich, um die Extinktionswerte in diesen Bereich zu bringen.

Alle Messungen sollten mit dem gleichen Spektralphotometer und der gleichen Methode (d. h. Messplatz oder Küvette) durchgeführt werden, da die Menge des erfassten gestreuten Lichts je nach optischer Konfiguration unterschiedlich ist. Wenn Sie ein anderes Spektralphotometer oder eine andere Methode verwenden, berechnen und wenden Sie einen Umrechnungsfaktor auf die berichteten Ergebnisse an. Um beispielsweise die OD-Messungen mit dem Messplatz mit denen einer Küvette zu vergleichen, kann ein Umrechnungsfaktor wie folgt berechnet werden:

Umrechnungsfaktor =Küvetten-OD/Messplatz-OD

Bewährte Methoden für OD600-Messungen

Vergewissern Sie sich, dass die Probe sich innerhalb der Extinktionsnachweisgrenzen des Geräts befindet.

Ermitteln Sie den Leerwert mit den Wachstums- oder Kulturmedien, in denen die Zellen von Interesse suspendiert sind.

Führen Sie einen blanking cycle (Leerwertzyklus) durch, um den Exktinktionsbeitrag Ihrer Medienlösung zu bestimmen. Wenn die Medienlösung bei oder in der Nähe der Analysewellenlänge (600 nm) eine starke Extinktion aufweist, müssen Sie möglicherweise eine andere Medienlösung oder Anwendung wählen. Weitere Informationen finden Sie unter Auswahl und Messung eines Leerwerts.

Nehmen Sie die erforderlichen Verdünnungen vor, um sicherzustellen, dass die Probenkulturen den linear-dynamischen Bereich des Assays nicht überschreiten, bevor die Kultur die stationäre Phase erreicht. Der lineare Bereich hängt weitgehend von der optischen Konfiguration ab und unterscheidet sich daher bei Messplatz- und Küvettenmessungen. Bestimmung des linearen Bereichs:

Messen Sie eine Reihe von Verdünnungen mit einer jungen Übernachtkultur (~16 Stunden) des Mikrobenstamms

Diagramm der OD600-Messungen gegen den Verdünnungsfaktor erstellen

Die obere Nachweisgrenze ist der gemessene OD600-Wert, bei dem keine lineare Korrelation zwischen Verdünnungsfaktoren und OD600-Messwerten mehr besteht.

Mischen Sie die Proben vorsichtig, aber gründlich, unmittelbar vor der Entnahme eines Aliquots zur Messung.

Für Mikrovolumenmessungen:

Stellen Sie sicher, dass die Messplätze ordnungsgemäß gereinigt und    konditioniert sind.

Vermeiden Sie beim Mischen und Pipettieren Blasenbildung.

Beginnen Sie die Messung sofort, um ein Absetzen oder Verdunsten zu vermeiden.

Halten Sie sich an bewährte Methoden für Mikrovolumenmessungen.

Verwenden Sie ein Probenvolumen von 2 µL. Gehen Sie zu Empfohlene Probenvolumina für weitere Informationen.

Verwenden Sie für verdünnte Proben, die bei 600 nm eine geringe Extinktion aufweisen, eine alternative Wellenlänge wie z. B. 400 nm, um die Extinktion zu messen, oder verwenden Sie Küvetten anstelle von Mikrovolumenmessungen.

Für Küvettenmessungen (nur NanoDrop UltraC und NanoDrop UltraC FL-Geräte):

Verwenden Sie saubere Kunststoff-, Glas- oder Quarzküvetten.

Halten Sie sich an bewährte Methoden für Küvettenmessungen.

Verwenden Sie nicht die automatische Rührfunktion für diesen Assay.