Wie bei den anderen Nukleinsäureanwendungen wird auch bei den Oligo-Anwendungen die Beer-Lambert-Gleichung verwendet, um die Extinktion mit der Konzentration auf der Grundlage des Extinktionskoeffizienten und der Schichtdicke der Probe zu korrelieren. Da Oligonukleotide kurze, einzelsträngige Moleküle (oder längere Moleküle mit sich wiederholenden Sequenzen) sind, hängen ihr Spektrum und ihr Extinktionskoeffizient (e) eng von der Basenzusammensetzung und -sequenz ab. (Die allgemein anerkannten Extinktionskoeffizienten und -faktoren für einzelsträngige DNA und RNA ermöglichen eine realistische Schätzung für natürliche, im Wesentlichen zufällige Sequenzen, jedoch nicht für kurze synthetische Oligosequenzen.) Um möglichst genaue Ergebnisse zu erzielen, wird zur Berechnung der Oligonukleotidkonzentration der exakte Wert von e260 verwendet. Mit der NanoDrop-Software können Sie die Basensequenz eines Oligonukleotids vor der Messung festlegen. Für jede eingegebene Basensequenz verwendet die Software die Gleichung auf der rechten Seite, um den Extinktionskoeffizienten zu berechnen. |
|
Extinktionskoeffizienten für Oligonukleotide Die Software verwendet die Nächste-Nachbar-Methode und die folgende Formel, um die molaren Extinktionskoeffizienten für bestimmte Oligonucleotid-Basensequenzen zu berechnen: ![]()
Wobei: |
Tipp: Der Extinktionskoeffizient ist für jedes Oligonukleotid wellenlängenspezifisch und kann durch Puffertyp, Ionenstärke und pH-Wert beeinflusst werden. |
|
|
Die berechneten Nukleinsäurekonzentrationen werden auf der Grundlage des Extinktionswerts bei 260 nm, des verwendeten Faktors und der Schichtdicke der Probe berechnet. Eine Einzelpunkt-Basislinienkorrektur (oder Analysenkorrektur) kann ebenfalls angewendet werden. Die Konzentration wird in Masseeinheiten angegeben. Zur Umrechnung der Konzentration von Masse in Mol-Einheiten auf der Grundlage der Probensequenz stehen im Internet Rechner zur Verfügung. Die Extinktionswerte bei 260 nm, 280 nm und manchmal 230 nm werden zur Berechnung der Reinheitsverhältnisse für die gemessenen Nukleinsäureproben verwendet. Verunreinigungen in der Probe,
|
|
Messwerte Hinweis: Bei Extinktionsmessungen von Mikrovolumina und Messungen mit nicht standardisierten Küvetten (andere Küvetten als 10 mm-Küvetten) werden die Spektren auf das Äquivalent einer 10 mm-Schichtdicke normalisiert.
• Die Extinktionswerte der Nukleinsäuren werden bei 260 nm unter Verwendung des normalisierten Spektrums gemessen. Wenn die Basislinienkorrektur nicht ausgewählt ist, wird der E260-Wert wie angegeben angezeigt. • Wenn die Basislinienkorrektur aktiviert ist, wird der Extinktionswert bei der Korrekturwellenlänge von der Probenextinktion bei 260 nm abgezogen. Die korrigierte Extinktion bei 260 nm wird angegeben und zur Berechnung der Nukleinsäurekonzentration verwendet. E230, E280 Extinktion • Zur Berechnung der Verhältnisse E260/E230 und E260/E280 werden die normalisierte Extinktionswerte bei 230 nm, 260 nm und 280 nm verwendet. |
|
|
• Die Software wählt für Messungen von Mikrovolumen die optimale Schichtdicke, (zwischen 1,0 mm und 0,03 mm) basierend auf der Extinktion der Probe bei der Analysewellenlänge aus. • Bei Küvettenmessungen wird die nach dem Umschalten in den Küvettenmodus ausgewählte Schichtdicke verwendet (siehe Küvetteneinstellungen). • Die dargestellten Spektren und Extinktionswerte sind auf eine äquivalente Schichtdicke von 10 mm normiert. |
Die fünf Nukleotide, aus denen DNA und RNA bestehen, weisen sehr unterschiedliche E260/E280-Verhältnisse auf. Die geschätzten E260/E280-Verhältnisse für jedes unabhängig gemessene Nukleotid sind unten angegeben: Guanin: 1,15 Für eine bestimmte Nukleinsäuresequenz entspricht das E260/E280-Verhältnis in etwa dem gewichteten Mittel der E260/E280-Verhältnisse der vier vorhandenen Nukleotide. Hinweis: RNA hat in der Regel ein höheres 260/280-Verhältnis aufgrund des höheren Uracil-Anteils verglichen mit Thymin. |
|
• Nukleinsäurenkonzentration. Angabe in ausgewählten Einheiten (d. h. ng/µl, µg/µl oder µg/ml). Die Berechnungen basieren auf der modifizierten Gleichung des Beer'schen Gesetzes unter Verwendung des korrigierten Absorptionswerts der Nukleinsäuren.
• E260/E280 Reinheitsverhältnis. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 280 nm. • E260/E230 Reinheitsverhältnis. Verhältnis der korrigierten Extinktion bei 260 nm zur korrigierten Extinktion bei 230 nm. Hinweis: Die herkömmlichen Reinheitsverhältnisse (E260/E280 und E260/E230), die als Indikatoren für das Vorhandensein verschiedener Verunreinigungen in Nukleinsäureproben verwendet werden, gelten nicht für Oligonukleotide, da deren Spektrenformen stark von der Basenzusammensetzung abhängen. Weitere Informationen finden Sie in der Seitenleiste. |
• Berechnungen für Nukleinsäure-Messungen