Calcoli per le misurazioni con microarray
Come per le altre applicazioni di acido nucleico, l’applicazione Microarray utilizza una modifica dell’equazione di Beer-Lambert per calcolare la concentrazione del campione, in cui il coefficiente di estinzione e la lunghezza del percorso vengono combinati e indicati come “fattore”. L’applicazione Microarray dispone di sei opzioni (riportate a destra) per selezionare un fattore appropriato per ciascun campione misurato, da utilizzare in combinazione con la legge di Beer per calcolarne la concentrazione. Se il fattore è noto, scegliere l’opzione Custom Factor (Fattore personalizzato) e inserire il fattore in ng-cm/µL. In caso contrario, scegliere l’opzione che meglio corrisponde alla soluzione campione. Suggerimento: idealmente, il fattore o coefficiente di estinzione dovrebbe essere determinato empiricamente utilizzando una soluzione dell’acido nucleico oggetto di studio a una concentrazione nota utilizzando lo stesso tampone. |
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Opzioni disponibili per i fattori • dsDNA (fattore = 50 ng-cm/µL) • ssDNA (fattore = 33 ng-cm/µL) • RNA (fattore = 40 ng-cm/µL) • Oligo DNA (calcolato a partire dalla sequenza nucleotidica del DNA inserita dall’utente) • Oligo RNA (calcolato a partire dalla sequenza nucleotidica dell’RNA inserita dall’utente) • Fattore personalizzato (fattore inserito dall’utente compreso tra 15 ng-cm/µL e 150 ng-cm/µL Nota: per ulteriori informazioni, vedere Tipo di campione. |
Le concentrazioni di acido nucleico calcolate si basano sul valore di assorbanza a 260 nm, sul fattore utilizzato e sulla lunghezza del percorso del campione. È inoltre possibile applicare una correzione della linea di base a punto singolo (o correzione dell’analisi). La concentrazione è riportata in unità di massa. In Internet sono disponibili calcolatori per convertire la concentrazione da unità di massa a unità molari in base alla sequenza del campione. Valori di assorbanza a 260 nm, 280 nm e talvolta 230 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti di purezza per i campioni di acido nucleico misurati. I rapporti di purezza sono sensibili alla presenza di contaminanti nel campione, come solventi residui e reagenti tipicamente utilizzati durante la purificazione del campione.
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Valori misurati Nota: il valore di assorbanza a 850 nm viene sottratto da tutte le lunghezze d’onda dello spettro. Di conseguenza, l’assorbanza a 850 nm è pari a zero negli spettri visualizzati. Inoltre, per le misurazioni dell’assorbanza microvolumetrica e le misurazioni effettuate con cuvette non standard (diverse da 10 mm) gli spettri sono normalizzato a un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm.
• I valori di assorbanza dell’acido nucleico per tutti i tipi di campioni di microarray vengono misurati a 260 nm utilizzando lo spettro a 850 nm corretto e normalizzato. • Selezionando Analysis Correction (Correzione dell’analisi), il valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di correzione viene sottratto dall’assorbanza a 260 nm. • Selezionando uno o più coloranti, anche i valori di correzione del colorante a 260 nm vengono sottratti dall’assorbanza a 260 nm. • L’assorbanza corretta finale a 260 nm viene riportata e utilizzata per calcolare la concentrazione del campione. • Per calcolare un rapporto A260/A280 si utilizza un valore di assorbanza 850-corretto e normalizzato a 280 nm (meno la correzione del colorante A280). |
Le concentrazioni di colorante sono calcolate in base al valore di assorbanza alla lunghezza d’onda di analisi del colorante, al coefficiente di estinzione del colorante e alla lunghezza del percorso del campione.
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• I valori di assorbanza del colorante sono misurati a specifiche lunghezze d’onda. Vedere l’editor dei coloranti/cromofori per le lunghezze d’onda di analisi utilizzate. • I valori di assorbanza del colorante corretti per la linea di base sono riportati e utilizzati per calcolare le concentrazioni di colorante. Correzione del colorante • I coloranti predefiniti hanno valori di correzione noti per A260 e A280. Vedere l’editor dei coloranti/cromofori per i valori di correzione utilizzati.
• Le correzioni del colorante A260 vengono sottratte dal valore di assorbanza A260 utilizzato per calcolare la concentrazione di acido nucleico e dal valore di assorbanza A260 utilizzato per calcolare il rapporto di purezza A260/A280. |
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Lunghezza del percorso del campione • Per le misurazioni microvolumetriche, il software seleziona la lunghezza ottimale del percorso (tra 1,0 mm e 0,03 mm) in base all’assorbanza del campione alla lunghezza d’onda dell’analisi. • Per le misurazioni in cuvetta, viene utilizzata la lunghezza del percorso selezionata dopo essere passati alla modalità cuvetta (vedere Cuvette Settings (Impostazioni cuvetta)). • Gli spettri e i valori di assorbanza visualizzati sono normalizzati a un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm. |
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• Concentrazione di acido nucleico. Riportato nell’unità selezionata (vale a dire, ng/µL, µg/uL o µg/mL). I calcoli si basano sull’equazione della legge di Beer modificata utilizzando il valore corretto di assorbanza dell’acido nucleico.
• Rapporto di purezza A260/A280. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 280 nm. Un rapporto di purezza A260/A280 di ~1,8 è generalmente accettato come “puro” per il DNA (~2,0 per l’RNA). Le soluzioni acide possono rappresentare un valore inferiore a 0,2-0,3; vale il contrario per le soluzioni di base. • Concentrazione di colorante 1/colorante 2. Riportata in pmol/µL. I calcoli si basano sull’equazione della legge di Beer utilizzando valori di assorbanza del colorante corretti per la linea di base.
Nota: sebbene i rapporti di purezza siano importanti indicatori della qualità del campione, il miglior indicatore della qualità del DNA o dell’RNA è la funzionalità nell’applicazione a valle di interesse (ad esempio, microarray).
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• Calcoli per le misurazioni degli acidi nucleici