L’applicazione Protein A280 utilizza
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Equazione Beer-Lambert (risolta per la concentrazione) c = A/ (e * b) dove: A = assorbanza UV in unità di assorbanza (AU) e = = coefficiente di assorbanza molare (o coefficiente di estinzione) dipendente dalla lunghezza d’onda in litri/mol-cm b = lunghezza del percorso in cm c = concentrazione dell’analita in moli/litro o molarità (M) Nota: dividendo l’assorbanza misurata di una soluzione campione per il suo coefficiente di estinzione molare si ottiene la concentrazione molare del campione. Vedere Coefficienti di estinzione pubblicati per ulteriori informazioni sui valori di concentrazione molare rispetto ai valori di concentrazione di massa.
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Il coefficiente di estinzione di un peptide o di una proteina è correlato alla sua composizione in amminoacidi triptofano (W), tirosina (Y) e cisteina (C). Suggerimento: il coefficiente di estinzione è specifico per la lunghezza d’onda per ciascuna proteina e può essere influenzato dal tipo di tampone, dalla forza ionica e dal pH. |
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Coefficienti di estinzione per le proteine A 280 nm, il coefficiente di estinzione è approssimato dalla somma ponderata dei coefficienti di estinzione molare a 280 nm dei tre aminoacidi costituenti, come descritto in questa equazione: e = (nW * 5.500) + (nY * 1.490) + (nC * 125) dove: |
Questa applicazione offre sei opzioni (mostrate a destra) per selezionare un coefficiente di estinzione appropriato per ciascun campione misurato, da utilizzare in combinazione con la legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. Se il coefficiente di estinzione del campione è noto, scegliere l’opzione e + MW (molare) o e1% (massa) e immettere il valore. In caso contrario, calcolare il coefficiente di estinzione o scegliere l’opzione che meglio si adatta alla soluzione campione. Suggerimento: idealmente, il coefficiente di estinzione dovrebbe essere determinato empiricamente utilizzando una soluzione della proteina in studio a una concentrazione nota utilizzando lo stesso tampone.
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Opzioni disponibili per il coefficiente di estinzione • 1 Abs = 1 mg/mL, dove il tipo di campione e/o il coefficiente di est. è sconosciuto (produce una stima approssimativa della concentrazione proteica) • BSA (Albumina sierica bovina, 6,7 L/gm-cm) • IgG (qualsiasi anticorpo di mammifero, 13,7 L/gm-cm) • lisozima (lisozima dell’albume d’uovo, 26,4 L/gm-cm) • Altre proteina (e + MW), coefficiente di est. molare specificato dall’utente • Altre proteine (e1%), coefficiente di est. di massa specificato dall’utente Nota: per ulteriori dettagli, vedere Tipo di campione. |
Le concentrazioni proteiche calcolate si basano sul valore di assorbanza a 280 nm, sul coefficiente di estinzione selezionato (o inserito) e sulla lunghezza del percorso del campione. È possibile applicare una correzione della linea di base a punto singolo (o correzione dell’analisi). La concentrazione è riportata in unità di massa. In Internet sono disponibili calcolatori per convertire la concentrazione da unità di massa a unità molari in base alla sequenza del campione.
I valori di assorbanza a 260 nm e 280 nm vengono utilizzati per calcolare i rapporti di purezza per i campioni di proteine misurati. I rapporti di purezza sono sensibili alla presenza di contaminanti nel campione, come solventi residui e reagenti tipicamente utilizzati durante la purificazione del campione. |
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Assorbanza A280 Nota: le misurazioni dell’assorbanza microvolumetrica e le misurazioni effettuate con cuvette non standard (diverse da 10 mm) sono normalizzate con un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm.
• I valori di assorbanza delle proteine sono misurati a 280 nm utilizzando lo spettro normalizzato. Se la correzione della linea di base non è selezionata, si tratta del valore A280 riportato e del valore utilizzato per calcolare la concentrazione proteica. • Se la correzione della linea di base è selezionata, il valore di assorbanza normalizzato e corretto per la linea di base a 280 nm viene riportato e utilizzato per calcolare la concentrazione proteica. Assorbanza A260
• Il valore di assorbanza normalizzato e corretto per la linea di base (se selezionato) a 260 nm viene utilizzato per calcolare i rapporti A260/A280.
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Lunghezza del percorso del campione • Per le misurazioni microvolumetriche, il software seleziona la lunghezza ottimale del percorso (tra 1,0 mm e 0,03 mm) in base all’assorbanza del campione alla lunghezza d’onda dell’analisi. • Per le misurazioni in cuvetta, viene selezionata la lunghezza del percorso dopo il passaggio alla modalità cuvetta. (vedere Cuvette Settings (Impostazioni della cuvetta). • Gli spettri e i valori di assorbanza visualizzati sono normalizzati a un equivalente della lunghezza del percorso di 10 mm. |
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• Concentrazione proteica. Riportata nell’unità selezionata (mg/mL o µg/mL). I calcoli si basano sull’equazione di Beer-Lambert utilizzando il valore di assorbanza della proteina corretto. • Rapporto di purezza A260/A280. Rapporto tra assorbanza corretta a 260 nm e assorbanza corretta a 280 nm. Un rapporto di purezza A260/A280 di ~0,57 è generalmente accettato come “puro” per le proteine. Nota: sebbene i rapporti di purezza siano importanti indicatori della qualità del campione, il miglior indicatore della qualità della proteina è la funzionalità nell’applicazione a valle di interesse (ad esempio, la PCR in tempo reale). • Tipo di campione. Determina il coefficiente di estinzione utilizzato insieme alla legge di Beer per calcolare la concentrazione del campione. • Correzione della linea di base. Lunghezza d’onda selezionata per la correzione della linea di base e l’assorbanza rilevata a quella lunghezza d’onda. • Posizione. Visualizza se la misurazione è stata effettuata in modalità piedistallo o cuvetta. • Lunghezza d’onda monitorata. Inserire un’ulteriore lunghezza d’onda di cui si desidera includere il valore di assorbanza nel report. • Coefficiente di estinzione di massa (soluzione all’1%). • Coefficiente di estinzione molare. • Peso molecolare. • Contaminante. Se un contaminante è stato identificato dal software Acclaro, il contaminante verrà visualizzato in questa colonna. • Corretto. Visualizza la concentrazione corretta dell’analita determinata utilizzando il software Acclaro, se disponibile. • Agitatore. Viene visualizzato “Off” quando non viene usata la funzione agitatore su un modello di cuvetta. Quando si utilizza la funzione agitatore, viene visualizzata la velocità di agitazione.
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• Riscaldatore. Verrà visualizzato “Off” o “On” per indicare se la porta della cuvetta è stata riscaldata durante la misurazione. • Temperatura misurata. Sarà visualizzata la temperatura della porta della cuvetta durante la misurazione. • Temperatura target. Sarà visualizzata la temperatura desiderata della porta della cuvetta. |