Misura la concentrazione proteica totale di campioni di proteine non purificati utilizzando un reagente colorimetrico di rilevamento proprietario. |
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Principio del saggio Protein Pierce 660
Il saggio Protein Pierce 660 si basa sul legame di un complesso colorante-metallo proprietario con le proteine in condizioni acide che provoca uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante, che viene misurato a 660 nm Il complesso colorante-metallo è di colore bruno-rossastro e diventa verde dopo il legame con le proteine. Il cambiamento di colore è prodotto dalla deprotonazione del colorante a pH basso ed è facilitata dalle interazioni con gruppi di amminoacidi caricati positivamente nelle proteine. Il colorante interagisce principalmente con residui basici, come istidina, arginina e lisina e, in misura minore, tirosina, triptofano e fenilalanina, presenti nelle proteine. Il prodotto di reazione viene misurato a 660 nm e corretto per la linea di base utilizzando il valore di assorbanza a 750 nm.
Il colore prodotto nel saggio è stabile e aumenta in proporzione a un’ampia gamma di concentrazioni proteiche crescenti. È possibile aggiungere un reagente opzionale di compatibilità con detergenti ionici (Ionic Detergent Compatibility Reagent, [IDCR]) al reagente del saggio per aumentare la compatibilità con elevate quantità di detergenti ionici, incluso il tampone campione Laemmli SDS con blu di bromofenolo. L’IDCR si dissolve completamente mediante miscelazione accurata e non ha alcun effetto sul saggio. Kit preformulati di materiale legante le proteine sono disponibili presso il produttore o presso un distributore locale. Per informazioni sull’IDCR, rivolgersi al produttore del kit.
Kit e protocolli del saggio delle proteine
Far riferimento al sito Web di NanoDrop per kit e protocolli aggiornati per gli strumenti NanoDrop Ultra. Seguire le raccomandazioni del fabbricante del kit di saggio per tutti gli standard e i campioni (sconosciuti). Assicurarsi che ciascuno sia sottoposto alla stessa tempistica e alla stessa temperatura per tutta la durata del saggio.
Gli standard proteici per la generazione di una curva standard possono inoltre essere forniti dal fabbricante del kit. Poiché i piedistalli NanoDrop One possono misurare concentrazioni proteiche più elevate rispetto agli spettrofotometri tradizionali a cuvette, potrebbe essere necessario fornire i propri standard proteici a concentrazioni più elevate rispetto a quelle fornite dal fabbricante. Ad esempio, possono essere necessari standard aggiuntivi per garantire che la curva standard copra l’intervallo dinamico del saggio e l’intervallo previsto dei campioni sconosciuti.
Curve standard di Protein Pierce
Per l’analisi colorimetrica delle proteine è necessaria una curva standard.
• Ogni esperimento richiede una curva standard. È possibile eseguire una nuova curva standard selezionando l’opzione Setup standards (Imposta standard) o importare lo standard da un esperimento eseguito in precedenza selezionando Load Standards (Carica standard) nella schermata di configurazione dell’applicazione.
Per ulteriori informazioni, vedere Utilizzo delle curve standard.